Flt3配体胞外域的原核表达纯化及活性鉴定

目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,诱导hFLext蛋白表达、纯化及活性鉴定.方法:以人淋巴细胞cDNA文库为模板,克隆hFlext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定.细胞增殖实验检测其生物学活性.结果:成功克隆获得hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21,经1 mM IPTG 30℃诱导12 h,成功表达Trx-hFLext融合蛋白,主要以包涵体形式存在.经8M尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.细胞增殖实验证实其具有生物学活性,能够有效刺激脐血细胞增殖.结论:成功构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hFLext融合蛋白,为造血干/祖细胞的体外扩增研究奠定了基础.     

内生真菌Shiraiasp.Slf 14中菊粉酶基因的克隆、表达及包涵体复性

为了实现内生真菌Shiraia sp.Slf 14菊粉酶基因在大肠杆菌中的高效表达,建立有效的包涵体复性技术,获得有活性的重组菊粉酶,本研究通过提取Shiraia sp.Slf 14的总RNA,反转录合成cDNA,设计PCR引物扩增出菊粉酶基因,将其克隆至pET-22b(+)载体后转入E.coli BL21(DE3),利用SDS-PAGE法检测IPTG诱导表达后重组蛋白的表达情况,并进一步检测了包涵体复性及重组酶酶活情况,最终成功获得了相对分子量为62.07 kD的重组蛋白,成功复性包涵体,复性率为25.23%,重组菊粉酶活力为6.84 U/m L。本研究为活性重组菊粉酶的获得及包涵体复性提供了新的方法和依据。     

MMP-9-PEX原核表达、纯化及其对结肠癌细胞侵袭能力的影响

用RT-PCR法扩增出基质金属蛋白酶-9(MMP-9)C末端血红素结合蛋白样结构域(PEX),克隆至表达载体pET32a中并转化至E.coilBL21(DE3),经IPTG诱导后在约为42kDa处发现有外源基因的表达,密度扫描显示表达蛋白含量占菌体总蛋白的50%左右。重组蛋白质pET32a/PEX主要以包涵体形式表达,其在上清液中的含量极微。含8mol/L尿素和10mmol/LDTT的裂解缓冲液溶解的包涵体采用金属整合层析有效分离出目标蛋白,纯化后pET32a/PEX蛋白质的纯度大于90%。在Transwell实验中发现复性纯化后的重组蛋白质pET32a/PEX能抑制结肠癌细胞的侵袭,且呈剂量依赖性。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其活性的鉴定

商品化的乙醛脱氢酶主要从动物细胞、肝细胞线粒体中提取,其来源受到很大的限制,而且价格昂贵。为了解决乙醛脱氢酶原料有限的问题,利用微生物发酵法获取乙醛脱氢酶。将人乙醛脱氢酶2基因(aldh2)克隆至原核表达载体p ET32a中,构建重组载体p ET32a-ALDH2。将构建的重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白得到大量表达;且对诱导表达条件进行优化。结果显示,在37℃,1.0 mmol/L IPTG诱导表达6 h为最优表达条件。由于目的蛋白几乎都是以包涵体形式表达,为了得到有活性的乙醛脱氢酶,对包涵体变性、复性和纯化进行了研究。试验数据显示,酶的最终得率为14.49 U/L。并通过用Bradford法,测定复性蛋白的浓度约为77μg/m L,进行活性检测表明,该复性蛋白具有乙醛脱氢酶活性,酶活性约为1.449 U/m L。通过构建重组载体p ET32a-ALDH2和优化表达条件,aldh2在原核表达宿主E.coli BL21(DE3)得到大量表达;此外,利用透析复性法得到的复性蛋白酶活性有所提高。     

人C反应蛋白在不同原核表达载体及菌株中的表达及免疫反应性分析

构建人C反应蛋白(CRP)原核表达载体,并分别将其转化进入E.coli BL21(DE3)和Rosetta gami 2(DE3)p Lys S中,诱导CRP重组蛋白的表达;主要运用了基因工程,亲和层析及透析复性等方法。成功构建了CRP原核表达载体及菌株。经IPTG诱导后,得到了不同的重组CRP蛋白。结果表明,相同表达载体在不同的表达菌株中的表达情况有一定差别,分别在大肠杆菌及Rosetta gami2(DE3)p Lys S中表达并得到了重组CRP的包涵体,对复性后的CRP重组蛋白进行Westen blotting及ELISA检测,结果表明原核表达的重组CRP蛋白的免疫反应性很低,CRP蛋白发挥免疫活性需要以五聚体形式存在。     

拟态弧菌VMH蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的实现拟态弧菌热不稳定性溶血素(VMH)的原核表达,制备兔抗VMH蛋白的多克隆抗体。方法根据GenBank上已有的拟态弧菌vmh基因序列,设计并合成引物,通过PCR方法扩增vmh基因。PCR纯化产物酶切后,定向插入到PET-32a表达载体构建重组表达质粒PET-32a-vmh。重组表达质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞,在IPTG诱导下进行VMH蛋白表达。SDS-PAGE分析重组VMH蛋白(rVMH)的表达形式,并分别采用兔血平板扩散法和Western blot检测其溶血活性和免疫反应性。用纯化的rVMH蛋白免疫新西兰大白兔,3次免疫后采集免疫血清,采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法纯化多克隆抗体,并检测其纯度与效价。结果重组表达质粒PET-32a-vmh诱导表达后,经SDS-PAGE分析发现分子量约为77.8kDa的rVMH蛋白主要以包涵体形式表达,该蛋白经变性复性后具有溶血活性和免疫反应性。兔抗rVMH蛋白的多克隆抗体经纯化后,其纯度达95%,ELISA效价为1∶26843545600,琼扩效价为1∶32。结论成功制备了rVMH蛋白及其多克隆抗体,为进一步采用噬菌体肽库筛选技术鉴定VMH蛋白表位提供了物质基础。     

牙鲆甲状腺激素受体TRaA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达载体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达。表达菌株经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h后,重组蛋白TRαA表达并形成包涵体。SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。Dotblotting检测抗体效价达1:200000,检测证明抗体特异性良好。此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合,表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达栽体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达.表达菌株经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,重组蛋白TRaA表达并形成包涵体.SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物.包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好.用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体.Dot blotting检测抗体效价达1:200 000,检测证明抗体特异性良好.此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合.表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控.     

地衣芽孢杆菌E7氨肽酶的异源表达及其在高效蛋白水解中的应用

【目的】将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)E7氨肽酶基因pepN克隆到大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中,实现氨肽酶Ec PepN的异源表达,研究重组酶的酶学性质及其与碱性蛋白酶协同作用,高效水解大豆蛋白和酪蛋白,产生小分子活性肽和游离氨基酸。【方法】以地衣芽孢杆菌E7基因组DNA为模板,将氨肽酶基因pepN克隆到载体pET28a中,构建重组表达载体pET28-pepN,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经DNA测序验证,获得重组菌E. coli BL21/pET28-pepN。利用镍离子亲和层析柱对重组酶进行分离纯化,研究纯酶的pH和温度稳定性、半衰期和NaCl的耐受性等酶学性质。以商品化氨肽酶与碱性蛋白酶协同作用为对照,重组酶Ec PepN与碱性蛋白酶协同水解大豆蛋白和酪蛋白,测定水解产物中小分子活性肽和游离氨基酸的组成。【结果】Ec PepN在大肠杆菌BL21中可溶性表达,SDS-PAGE分析表明纯化的重组酶在52kDa左右显示单一条带。在7种测定底物中,Ec PepN的最适底物为Ala-pNA。在最适条件(pH 9.0和50°C...     

猪尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

本研究报道了猪尿酸氧化酶(Porcine urate oxidase,pUOX)的原核表达载体的构建、pUOX的蛋白表达条件的优化以及对pUOX经纯化后进行活性检测和酶学性质分析。利用RT-PCR从猪肝总RNA中克隆pUOX,定向插入原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET30a(+)/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。重组质粒pET30a(+)/pUOX经双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建了重组表达载体。重组表达菌经IPTG诱导表达了约为41kD的蛋白,与预期分子量一致,并对pUOX蛋白表达条件进行了优化,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中,包涵体经过变性、复性后,用Ni2+-NTA对复性蛋白进行亲和纯化,并对纯化蛋白进行了活性检测和酶学性质分析,纯化的重组pUOX的比活为50.63IU/mg,并发现重组蛋白在最佳温度、热稳定性等方面与天然pUOX相同,为后续动物实验奠定重要的基础。     

Embryo and Endosperm Function and Failure inSolanumSpecies and Hybrids

Although the importance of the endosperm as a food store inmany angiosperm seeds is well known, its significance duringearly embryogenesis has been neglected. In many interspecifichybrids, and in some other situations, embryos do not developfully and abort. It has often been stated that this is causedby the endosperm failing to conduct sufficient nutrients tothe embryo, but seldom has it been suggested that the endospermactively controls most of the early stages of morphogenesisof the embryo. Information gleaned from a broad survey of theliterature, combined with additional evidence presented here,obtained fromSolanum incanumand interspecific hybrids, indicatethat the endosperm is dynamic and very active in regulatingearly embryo development. This requires highly integrated geneticcontrol of rapidly changing metabolism in the endosperm. Ininterspecific hybrids, lack of coordination may cause unbalancedproduction of growth regulating substances by the endospermand hence abortion of the embryo, or even unregulated productionof nucleases and proteases resulting firstly in autolysis ofthe endosperm and then digestion of the embryo. The endospermmay thus serve to detect inappropriate hybridization of speciesor ploidy levels and so prevent waste of resources by producingseeds that would result in sterile hybrids or unthrifty subsequentgenerations. This discriminatory function of the endosperm hasdiminished during evolution and domestication of the crop plantSolanummelongenaL.Copyright 1998 Annals of Botany Company Solanum, embryo morphogenesis, endosperm, hybrid, seed development.     

环腺苷酸应答元件结合蛋白与学习记忆

环腺苷酸(cAMP)应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)是一种核转录因子,可与cAMP反应元件结合,调节基因转录,具有调节精子生成,昼夜节律,学习记忆等功能.近年来关于其在学习记忆中的作用成为医学研究热点.CREB是神经元内多条信息传递途径的汇聚点,参与长时记忆形成和突触可塑性.长时记忆(long-term memory)形成需依赖CREB介导的基因转录,干扰或抑制CREB活性可破坏长时记忆.长时程增强(long-term potentiation,LTP)是研究学习记忆的理想模型,在LTP诱导和维持过程中均可观察到CREB活性持续升高.但增龄过程中,海马CREB活性下降,影响学习记忆功能,与许多神经退行性疾病发生有关.     

HIFs and tumors--causes and consequences

For most organisms oxygen is essential fo life. When oxygen levels drop below those required to maintain the minimum physiological oxygen requirement of an organism or tissue it is termed hypoxia. To counter act possible deleterious effects of such a state, an immediate molecular response is initiated causing adaptation responses aimed at cell survival. This response is mediated by the hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), which is a heterodimer consisting of an alpha- and a beta-subunit. HIF-1 alpha protein is stabilized under hypoxic conditions and therefore confers selectivity to this response. Hypoxia is characteristic of tumors, mainly because of impaired blood supply resulting from abnormal growth. Over the past few years enormous progress has been made in the attempt to understand how the activation of the physiological response to hypoxia influences neoplastic growth. In this review some aspects of HIF-1 pathway activation in tumors and the consequences for pathophysiology and treatment of neoplasia are discussed.     

Pragmatic Women and Body Politics and Maternities and Modernities: Colonial and Postcolonial Experiences in Asia and the Pacific

Pragmatic Women and Body Politics. Margaret Lock and Patricia A. Kaufert. eds. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1998. xii +364 pp.
Maternities and Modernities: Colonial and Postcolonial Experiences in Asia and the Pacific. Kalpana Ram and Margaret Jolly. eds. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1998. xiv. 305 pp.