一种快速简便的CaCl2质粒转化方法

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴3～10min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2h减至3～10min.同时探讨了Ca2 浓度、4℃保存时间等因素对感受态细胞转化效率的影响     

一种快速简便的CaCl2质粒转化方法

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴３～10 min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2 h减至3～10 min.同时探讨了Ca²⁺浓度、4℃保存时间等因素对感受态细胞转化效率的影响.     

转化条件对质粒DNA转化大肠杆菌的影响

研究了质粒DNA大小、质粒DNA浓度、CaCl2 浓度、热休克时间及感受态细胞保藏时间等因素对大肠杆菌HB1 0 1和JM1 0 5转化频率的影响 ,并对转化子中质粒DNA进行了分离、酶切、琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明 ,CaCl2 浓度、质粒大小和浓度 ,以及感受态细胞的活力对转化频率有重要影响 ,42℃热休克处理可以提高转化频率。     

TSS及CaCl2转化方法的比较

目的 :比较 TSS及 Ca Cl2 二种转化方法的转化效率。方法 :用 TSS及 Ca Cl2 方法转化质粒 p QE,并比较二者的转化效率及简便性。结果 :Ca Cl2 方法的转化效率为 5 .6× 10 6转化子 / μg DNA,TSS方法转化效率为 8.2× 10 7转化子 / μg DNA;TSS转化方法不需要 42℃热休克。结论 :TSS转化方法优于 Ca Cl2 转化方法。     

优化噬热栖热菌的遗传转化体系

[目的]优化噬热栖热菌Thermus thermophilus的转化体系。[方法]将质粒DNA的形态、浓度及转化时间作为变量设计噬热栖热菌T.thermophilus的转化体系,以通过直接双交换同源重组法获取Δpyr E突变体的概率为依据判定转化效率。[结果]在转化时间为2 h,使用3.0μg/m L线性质粒DNA,获取表观Δpyr E的概率为3.44×10^-5;而使用同样浓度的超螺旋质粒DNA,该概率可达1.03×10^-3;说明超螺旋质粒的转化效率高于线状质粒。质粒DNA的使用浓度及转化反应时间对转化效率亦有影响,但并非完全成正相关。使用浓度为15μg/m L超螺旋质粒DNA,在转化时间为3 h时,获取表观Δpyr E的概率达到最大值(1.36×10^-2);超过该阈值,转化效率降低。[结论]在T.thermophilus中,通过优化转化体系将基因无痕敲除突变体获取概率提高到10^-2。     

酿酒酵母遗传缺陷型菌株化学转化方法研究

目的:通过改善转化条件,提高缺陷型酿酒酵母DNA转化效率。方法:以醋酸锂化学转化法为基础,以酿酒酵母菌株fab1::KAN作为遗传转化受体,以敲除MZM1基因为转化目的,对影响遗传缺陷型菌株转化效率的参数(醋酸锂前处理、热激时间及转化后复苏时间)进行优化,确定适合缺陷型酵母DNA转化的最佳方法。结果:不同时间(30 min,60 min和120 min)醋酸锂的前处理均可以提高其转化效率,热激前使用醋酸锂处理酵母30 min转化效率最高;热激10 min是转化效率由高到低的转折点,30 min热激明显降低了转化效率;YPD培养基用于转化后酵母的复苏,随培养时间(30 min,60 min和120 min)的延长,酵母转化效率逐步增加,120 min作为热敏性菌株转化后的复苏时间较佳。结论:与野生型菌株类似,通过转化条件的优化,遗传缺陷型菌株的转化效率也可以满足大多数试验要求。     

一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA转化大肠杆菌的操作方法.采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞.以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth和植物双元表达栽体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1.质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后,直接涂布含有筛选抗生素的LB平板,于37℃培养12～16h.结果表明,用不同大小的质粒DNA转化不同的大肠杆菌菌株,都可以获得满足实验要求,转化效率可高达103～4阳性克隆/μg.该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用.     

大肠杆菌JM109感受态形成因素分析

目的:分析大肠杆菌JM109感受态形成因素,提高转化效率。方法:采用不同生长状态、不同转化溶液、不同保存时间及热激处理时间的细菌制备感受态,分析转化效率。结果:以20mmol/L MgCl2 80mmol/L CaCl2为处理液,经活化培养OD600为0.82的菌液制备感受态细胞,4℃放置12~24h之内,42℃热激处理60s,转化效率最高,可达9.8×106~1.2×107cfu/μg DNA(pUC19)。随着质粒长度增加,转化效率下降。结论:感受态细胞形成与生长状态关系密切,金属离子、有机溶剂对感受态的形成影响显著。感受态形成过程中,细胞可能发生了一系列的生理变化。     

高效、快速地将外源DNA导入根癌土壤杆菌

室温下用50mmol/LCaCl_2处理根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以制备感受态细胞,然后经0℃冰浴及28℃热击处理,成功地将Ti质粒中间载体(>10kb)导入了根癌土壤农杆菌中。转化效率每个活细胞可达10~(-4)～10~(-5)转化子或10~6转化子/μgDNA。探讨了该菌细胞生长状态、CaCl_2滚滚浓度、温度、液氮、热击、复苏时间以及感受态细胞于4℃或—20℃(加15％甘油)下保存时间对根癌土壤杆菌转化的影响。     

工业谷氨酸棒杆菌电转化整合效率的优化

研究不同因素对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,提高电转化效率。以产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌工业菌株a11为受体菌,大肠杆菌(Escherichia coli)JM109及质粒pk18mobsac B为载体,通过电转化方法研究了菌体最佳感受态性能、复苏培养基高渗溶液浓度、最适电场强度及电击后的热激培养对电转化效率的影响。对于谷氨酸棒杆菌a11而言,使用无痕的自杀载体电击转化,在感受态细胞OD_(600 nm)值为1.0~1.2,电场强度达到9.0 kV/cm,电转后46℃热激培养8 min,而且热激后继续保持37℃的适应性培养,电转化效率最高,达到1.8×10~3cfu/μg DNA。实现了工业谷氨酸棒杆菌的电转化效率的提高,也为其它谷氨酸棒杆菌电转化效率的提高提供参考方法。