转单、双Bt基因741杨外源基因表达和抗虫性比较

【目的】研究联合使用两种或两种以上的抗虫基因的抗虫效果, 同时鉴定并筛选出转双Bt基因741杨对鳞翅目和鞘翅目害虫有较强抗性的株系。【方法】选取转三基因（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741杨8个株系、 转双基因（Cry1Ac+API）741杨1个株系和转单基因（Cry3Aa）741杨3个株系为试材, 从外源基因PCR检测、 毒蛋白表达和抗虫性三方面对转基因株系进行对比分析。【结果】经PCR扩增后各转基因株系出现了预期的电泳条带。ELISA蛋白检测显示转基因株系中都有与所含基因相应的Bt杀虫蛋白表达。用转基因株系新鲜叶片进行柳蓝叶甲Plagiodera versicolora和美国白蛾Hyphantria cunea室内饲虫实验表明： 转入不同抗虫基因的杨树对昆虫的抗性具有选择性, 对非靶标昆虫没有毒杀作用。转双Bt基因741杨具有双抗性, 不同转基因株系表现出高中低的抗性水平： 在对柳蓝叶甲的抗性上, 筛选出的其中5个高抗株系（pCCA1, pCCA2, pCCA5, pCCA6和pCCA9）的抗性水平明显比含Cry3Aa单Bt基因的3个高抗株系（pCC11, pCC53和pCC84）高; 在对美国白蛾的抗性上, 有7个株系（pCCA2~pCCA7和pCCA9）的抗性水平与含Cry1Ac单Bt基因株系（pB29）表现一致, 只有1个株系（pCCA1）对美国白蛾表现出了极低的抗性。【结论】多个抗虫基因在741杨上的联合使用, 不仅扩大了抗虫谱, 其中的高抗株系还具有了更高的抗虫能力, 有效地发挥了基因的叠加效应。     

分子改造cryNAc基因的转基因水稻创制及其功能评价

利用蛋白质工程技术对Cry蛋白进行改造是创制新Bt蛋白的主要途径之一。Cry蛋白改造涉及结构域交换、定点突变、蛋白截断等多种方法。利用结构域交换、密码子优化方法对Bt基因进行合理化设计改造,获得新型Bt蛋白编码基因cryNAc,进一步利用农杆菌介导法转入吉林省水稻主栽品种吉粳88中,并开展了转基因后代的分子鉴定和抗虫性功能评价相关研究工作。分子检测结果表明cryNAc基因成功整合进入吉粳88基因组中,且稳定表达;CryNAc蛋白在各个发育时期根、茎、叶中的表达存在显著差异,灌浆期水稻叶片中蛋白表达量最高（2 959.73 ng/g）,分蘖期茎中蛋白表达量最低（150.9 ng/g）;田间接虫试验表明cryNAc转基因水稻抗二化螟的能力显著。上述结果表明cryNAc基因可作为新的cry基因用于作物遗传改良。     

NaCl胁迫对转基因杨树外源基因表达的影响

以具高抗虫性的转抗虫基因‘741杨’及在此基础上转入了发根农杆菌Ri质粒T-DNA株系的组培苗为材料,研究了转基因株系BtCrylAc抗虫基因和发根基因的表达及其对NaCl胁迫的反应。结果表明,转入Ri质粒T- DNA上的rol基因后,导致苗木根系数目增加,根系长度减小,IAA和GA含量显著提高,抗虫BtCrylAc基因编码的毒蛋白的表达量降低;随着NaCl胁迫强度的增加,苗高、根系数量、叶绿素含量及IAA、GA含量逐步降低,而根系的长度加大,Bt毒蛋白含量显著提高,表明NaCl胁迫使转基因杨外源Bt毒蛋白基因的表达增强,而发根农杆菌Ri质粒T-DNA的表达下降。     

NaCI胁迫对转基因杨树外源基因表达的影响

以具高抗虫性的转抗虫基因‘74l杨’及在此基础上转入了发根农杆菌融质粒T-DNA株系的组培苗为材料,研究了转基因株系BtCrylAc抗虫基因和发根基因的表达及其对NaCI胁迫的反应。结果表明,转入Ri质粒T-DNA上的rol基因后,导致苗木根系数目增加,根系长度减小,IAA和GA含量显著提高,抗虫BtCrylAc基因编码的毒蛋白的表达量降低;随着NaCI胁迫强度的增加,苗高、根系数量、叶绿素含量及IAA、GA含量逐步降低,而根系的长度加大,Bt毒蛋白含量显著提高,表明NaCI胁迫使转基因杨外源Bt毒蛋白基因的表达增强,而发根农杆菌．Ri质粒T-DNA的表达下降。     

Bt转基因抗虫植物研究进展

目前Bt成为世界上植物抗虫基因工程中研究和应用最多的基因。已经有多种转单一Bt和复合Bt的转基因玉米、棉花、马铃薯等作物得到大面积种植。还有许多新的具有良好抗虫性的Bt转基因植物,如水稻、大豆、油菜、苜蓿、花椰菜、蓖麻等已经试验成功,并逐渐推广种植。Bt转基因抗虫植物的培育为提高产量,减少杀虫剂的使用和保护环境做出了举足轻重的贡献。就Bt的分类、杀虫机理、Bt转基因抗虫植物的发展状况以及种植Bt抗虫植物对环境的影响进行了概述。     

转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用

苏云金芽胞杆菌基因是转基因抗虫作物中通用的外源功能基因,在绝大多数抗虫转基因作物中均有存在,然而Bt基因检测标准样品的缺乏却限制了我国转Bt基因抗虫作物检测工作的发展。为了弥补传统基体标准样品的缺失,首先将Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A 3种常用Bt外源基因克隆到pUC57质粒上,通过测序、酶切和qPCR等技术对质粒的序列和扩增功能进行了验证,然后对扩增效率和实际应用情况加以测试,评价其转基因检测的适用性,构建了质粒标准分子。结果显示,制备的质粒标准分子测序结果与靶标序列完全符合,酶切结果、qPCR扩增结果和扩增效率等均符合预期,在Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因特异性检测中的应用符合阳性对照要求,表明制备的阳性质粒标准分子能够作为转Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因qPCR基因特异性检测的阳性标准样品。     

转Bt基因抗虫玉米HGK60的农艺性状分析

为了确定转Bt cry1Ah抗虫玉米HGK60的自交系及其杂交后代外源基因的遗传表达稳定性和农艺性状,通过实时荧光定量PCR和ELISA分析外源基因的遗传表达稳定性,通过室内外生测和田间性状考量分析农艺性状。荧光定量PCR结果表明Bt cry1Ah基因在玉米的不同组织中可以正常转录,但RNA表达水平存在一定的差异;ELISA结果表明在转基因植株的不同发育时期、不同器官中Cry1Ah的蛋白表达量顺序:雄穗叶片苞叶籽粒花丝穗轴。两地连续三代的田间及室内抗虫性检测结果表明HGK60抗虫玉米对亚洲玉米螟均表现出很好的抗性。性状考量结果表明HGK60抗虫玉米与受体材料对照比较,种子发芽率、生育期、穗行数、穗长、千粒重等农艺性状均无显著差异。通过多年多点田间试验和分子检测结果证明HGK60转基因抗虫玉米中外源基因稳定的遗传和表达,对亚洲玉米螟有很好的抗性,农艺性状与对照材料无显著差异。HGK60转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟的良好抗性使其具有很好的产业化应用前景。     

转Cry1Ac活性杀虫蛋白及慈菇蛋白酶抑制剂B基因的棉花

根据植物基因的结构特征。合成了Cry1Ac活性杀虫蛋白的编码序列并与内质网定位肽编码序列组成嵌合杀虫蛋白基因Bt29K。构建了含Bt29K基因及慈菇蛋白酶抑制剂B（API-B）基因表达框的双抗虫基因植物表达载体。通过根癌土壤杆菌（Agrobacterium trmefaciens(Smith et TOwnsend)ConnLBA4404)介导转化了棉花（Gossypium hirsu-tunL.)的两个生产品种（系）。根据抗棉铃虫（Heliothis armigera)试验及农艺性状的观察调查结果。经6代筛选,获得了抗棉铃虫90.0%_99.7%且农艺性状优良的9个双价抗虫棉纯合品系。分子生物学分析结果表明,两个抗虫基因在棉花基因组中的插入拷贝数为1个或2个,活性Cry1Ac和API-B蛋白在转基因抗虫棉株系中的表达量分别约占总可溶性蛋白的0.17%和0.09%。对双抗纯合系植株及仅转Bt基因的棉花纯合系抗虫性检测结果表明前者的抗虫性明显高于后者,因此推断本研究采用的双抗虫基因表达载体构建策略是合理的。     

转双抗虫基因三倍体毛白杨外源基因表达及性状相关性分析

用部分改造的BtCry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂（API）基因构建的双抗虫基因表达载体,通过农杆菌介导法转化了三倍体毛白杨Populus tomentosa Carr.,获得一批转双抗虫基因株系。对转基因株系的抗虫毒蛋白表达进行了ELISA和Western Blot检测,同时用转基因株系叶片对杨扇舟蛾Clostera anachoreta Fabricius和舞毒蛾Lymantria dispar L.幼虫进行室内饲虫试验,并对各项外源基因表达指标进行了相关分析。结果表明：在检测的28个转基因株系中,对杨扇舟蛾高抗株系占总参试系号的41％,中抗系号占35.0％,低抗系号占24％,对舞毒蛾高抗株系占参试系号的70％。转基因植株可明显抑制存活幼虫的生长发育,且不同转基因株系饲养的幼虫发育存在显著差异。连续两年相关分析表明,不同转基因株系幼虫死亡率间存在极显著相关。转基因植株对舞毒蛾和杨扇舟蛾均表达出抗虫性,并存在极显著相关。ELISA检测结果表明,不同转基因株系Bt毒蛋白表达量存在差异,变化在0.0011％～0.0161％。转基因植株对害虫的杀虫效果与Bt杀虫蛋白的表达量存在显著相关,表明Bt毒蛋白在抗虫效果中占有重要地位。转基因植株对卡那霉素表现出一定的抗性,但与抗虫程度相关不明显,单纯用卡那霉素作为筛选手段并不能完全反映植株的真实抗虫效果。     

转基因抗虫烟草研究进展

烟草为模式植物,也是外源杀虫基因最早转化成功的植物。文章从转Bt内毒素基因,植物凝集素GNA,Plec,AHA基因,蛋白酶抑制剂PIⅠ,PIⅡ,MTI,SKTI基因,昆虫特异性神经毒素基因,几丁质酶基因,畸形细胞分泌蛋白基因以及双抗虫基因等方面综述了转基因抗虫烟草的抗虫性、转基因抗虫烟草的经济性状等,展望了转基因抗虫烟草的研究和应用前景,以期对烟草害虫的治理尤其是对其他转基因抗虫作物的培育和研究有借鉴作用。     

植物抗虫性物质烟碱的研究进展

烟碱是烟草(Nicotiana tobacum L.)重要的抗虫性物质。主要就烟碱在烟草体内的分布、生理作用、合成诱导、对昆虫的毒性以及昆虫对烟碱的适应性机制等方面的研究进展进行了综述。     

温度对转基因741杨抗虫性的影响

在不同温度下测定转基因741杨的抗虫性,发现转抗虫基因741杨的抗虫性与温度密切相关．随着温度的升高,舞毒蛾幼龄幼虫的总死亡率、累计死亡率均明显升高,且随着昆虫龄级的增加,幼虫对转基因株系和温度的敏感性逐渐降低．温度对取食对照株系的昆虫生长发育有促进作用．温度高,舞毒蛾幼虫的生长发育明显加快,历期缩短,各龄期体重、排粪量增长快,而以转基因杨饲喂的昆虫发育进度随温度变化差异不显著．对1998～2000年温度资料和相应的杨扇舟蛾死亡率建立了回归方程,各高抗和中抗株系的温度-昆虫死亡率曲线均表现为明显的回归关系．     

Transgenic Tobacco Plants with a Fully Synthesized GFM CryIA Gene Provide Effective Tobacco Bollworm (Heliothis armigera) Control

GFM CrylA gene is a fully modified synthetic gene derived from insecticidal crystal prorein gene of Bacillus thuringiensis Berliner (Bt). It was synthesized based on the codon usage of plant genes instead of changing the primary sequences of amino acids of insecticidal crystal protein (ICP) gene of Bacillus thuringiensis Htibner. To test the function of the synthetic GFM CrylA gene, we introduced the GFM CrylA gene into tobacco plant cells via an Agrobacterium tumefacieus (Smith et Townsedn) Conn binary vector system. As expected, the GFM CrylA gene is expressed under control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and allows efficient production of lepidopteran insectspecific toxic proteins in the transformed tobacco plants. Bioassays using transgenic tobacco plants with tobacco bollworm showed that the transgenic tobacco plants expressing proteins of GFM CrylA gene had effective control to tobacco bollworm. In this paper the authors firstly report the complete synthesis of GFM CryIA gene and the construction of plant expression vector pGBI4AB. The authors performed introduction of the synthetic GFM CrylA gene into the tobacco plants, and the integration of GFM CrylA gene into tobacco genome was confirmed by Southern blot analysis of the tobacco genomic DNA. The gene was efficiently expressed in the transgenic tobacco plants and effective tobacco bollworm control was verified by the insect-bioassays.     

Construction of a BAC Library for a Defoliating Insect-Resistant Soybean and Identification of Candidate Clones Using a Novel Approach

Positional cloning of an insect-resistance quantitative trait locus (QTL) requires the construction of a large-insert genomic DNA library from insect-resistant genotypes. To facilitate cloning of a major defoliating insect-resistance QTL on linkage group M of the soybean genetic map, a bacterial artificial chromosome (BAC) library for PI 229358 was constructed and characterized. The HindIII BAC library contains 55,296 clones with an average insert size 131 kb. This library represents a 6-fold soybean haploid genome equivalents, allowing a 99.8% probability of recovering any specific sequence of interest in soybean. BAC filters were screened with a genomic DNA probe Sat_258sc2 obtained through genome walking from flanking sequences of a simple sequence repeat (SSR) marker, Sat_258, which links to the insect-resistance QTL. Thirteen BAC clones were identified positive for Sat_258sc2, and two of them were confirmed to carry Sat_258. The results suggest that this library is useful in positional cloning of the major insect-resistance QTL, and the approach presented here can be used to screen a BAC library for a SSR marker without requiring the creation of BAC pools.     

MAR的分子结构

核基质（ｎｕｃｌｅａｒｍａｔｒｉｘ）是真核生物细胞核中存在的主要由非组蛋白性纤维蛋白组成的空间网架结构。它参与了真核生物几乎所有的细胞核功能,包括ＤＮＡ复制、ＲＮＡ的合成和调控以及ｈｎＲＮＡ的加工、染色体的功能构建、有丝分裂、甾类激素作用、病毒复制和...     

MAR的分子结构

核基质(nuclear matrix)是真核生物细胞核中存在的主要由非组蛋白性纤维蛋白组成的空间网架结构.它参与了真核生物几乎所有的细胞核功能,包括DNA复制、RNA的合成和调控以及hnRNA的加工、染色体的功能构建、有丝分裂、甾类激素作用、病毒复制和致癌作用等.最近的研究表明,核基质还与雌体细胞的第二条X染色体的钝化有关[1].这些生物学功能是核基质通过识别基因组中与之特异结合的DNA序列--MAR(matrix association region)来实现的.自从1984年Mirkovitch等在果蝇hsp70和组蛋白基因侧翼发现第一批MAR分子以来[2],已有大量的MAR在各种真核生物中被克隆和测序.作为真核染色质loop的边界元件(boundary elemnt)和染色质功能区域(fountional domain)的顺式作用元件[3],MAR为研究真核基因(或基因组)的结构和功能之间的对应关系提供了一种联系的纽带.表1中列出了截至1997年底所发现并鉴定的所有MAR分子,通过对这些MAR的序列分析,我们可以找到一些MAR的结构特征.     

几个棉花核不育抗虫杂交种(F1)的抗虫性及经济性状分析

用两个不抗虫和一个抗虫的核不育系为母本,用抗虫品系为父本,配制3个杂交组合(GA×HB、GA5×R27、GA18×HB),研究分析杂交种的抗虫性、产量性状和纤维品质.结果表明3个杂交组合均高抗棉红铃虫,GA5×R27和GA18×HB以及GA×HB分别抗、中抗棉铃虫;3个组合的产量和纤维品质均优于对照.用核不育系作母本,特别是用抗虫核不育系作母本生产抗虫杂种,比用人工去雄生产杂种种子成本低,且有较好的抗虫性和丰产性,因而在棉花生产上具有更加广阔的应用前景.     

转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因抗虫甘蓝植株的获得

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)栽培品种“京丰”和“迎春”,并分别获得了转基因再生植株。对NPTⅡ的ELISA检测表明,标记基因NPTⅡ已在再生植株中得到有效表达。对转化植株进行Southern blot分子杂交实验进一步证明CpTI基因已整合到甘蓝的基因组。实验室内的叶片离体饲虫及盆栽饲虫试验表明,转基因甘蓝对菜青虫具有一定抗性。实验中还观察到,采用愈伤组织分化途径可以获得较高的转化频率,但嵌合体较多;而直接分芽的途径转化率低,但嵌合体较少。     

An Insect-Resistant Transgenic Cabbage Plant with Cowpea Trypsin Inhibitor(CpTI) Gene

Cowpea trypsin inhibitor (CpTI) gene was transformed into Brassica oleracea var. capitara variety "Yingchun" and "Jingfeng" mediated by the Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pRCL27). Transgenic plants were obtained from transformed calli or explants. It was shown from the ELISA assay that NPT Ⅱgene was expressed in the transgenic cabbage cells. The integration of the CpTI gene into cabbage genome DNA was confirmed by Southem blotting. Insect-tolerance of the transgenic plants to Pieris rapae L. was observed by bioassays on the transgenic plants in the laboratory.