实验3 RNA的分离纯化

一、哺乳类细胞总RNA的提取 1.从培养细胞中提取 (1)准备10瓶(底面积为4.5×8.5cm~2)长得半满的培养细胞(约10~7个细胞)。 (2)吸去瓶中培养液,各加入5ml新鲜培养液,37℃培养4小时左右。 (3)吸去培养液,各加入5ml预冷的1×PBS溶液     

重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA

对基因工程菌Pichiapastoris的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌P .pastoris表达重组人血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 1 0g L ;发酵pH范围为 5 72～ 6 5 9;在摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产率却明显下降 ,符合y =1 2 941x- 0 50 59方程 (线性相关系数r=0 9789) ,其限制性因子很可能为溶氧。在分批发酵 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 (OD60 0 )为 2 0左右时 ,细胞生长的延迟期为 2 1 1h左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y =0 7841e0 .2 3 19t(线性相关系数r=0 .993 6 ) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 1 1 5g L— 1 6 0g L ,在 1 2 0h重组人血清白蛋白表达量最大达到 3 6g L。     

用填充床生物反应器连续灌流培养CHO细胞生产HBsAg

为了获得重组CHO细胞持续高效表达HBsAg的最佳条件 ,应用填充床生物反应器和聚酯片 ,连续灌流培养分泌HBsAg的重组CHO细胞 ,考察灌流培养基中葡萄糖浓度对细胞代谢和HBsAg生产的影响。连续培养 60天 ,细胞密度可达 5 0× 1 0 6 ml。灌流培养液中葡萄糖浓度从5 0g L增加到 7 6g L时 ,葡萄糖消耗速率和乳酸浓度均随之上升。当葡萄糖浓度继续增加至9 3g L时 ,葡萄糖消耗速率和乳酸浓度呈下降趋势 ;当将葡萄糖浓度降回至 7 6g L后又开始回升。培养过程中最高抗原滴度达 1∶5 1 2 ,出现在以含 5 0g L葡萄糖的培养液灌流阶段的末期 ,即第 2 6天 ,维持 1 0天左右即迅速下降至 1∶1 2 8水平。共收液 335L ,纯化后获得抗原蛋白2 1 3 0 4mg ,平均产率为 635 94μg L ,较传统转瓶工艺 ( 4 1 4μg L)提高 5 3 6%。表明CHO细胞较长时间处于高乳酸水平下 ( >30mmol L)会严重影响产物的表达 ,应控制灌流培养液中的葡萄糖浓度在较低水平 ,或通过适当提高灌流速率使培养基中乳酸水平维持在较低水平 ,从而有利于HBsAg的高效稳定表达     

酵母菌发酵产生酒精和二氧化碳的简易实验

酵母菌属兼性厌氧真核微生物 ,在缺氧时进行酒精发酵 ,积累酒精和二氧化碳。那么 ,如何通过实验来证明酵母菌在缺氧的条件下 ,发酵的产物是酒精和二氧化碳 ?现介绍一种简易的实验方法 :1　酵母菌的培养繁殖　取一定量的发面 (约乒乓球大小的一团 )放入 2 0 0 m L的烧杯内 ,再倒入浓度为 5 %的葡萄糖溶液至烧杯的 1 0 0 m L的刻度处 ,用玻璃棒搅拌均匀。盖上培养皿盖后 ,放在温暖的地方培养 3～ 4 h,以增加菌体数量。2　发酵产物制备　取 1支较大的试管 (2 0 mm× 2 0 0mm) ,将上述烧杯内的培养液用玻璃棒搅拌后倒入试管中 ,倒至约距试管口…     

蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(CHX)对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究了蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮 (CHX)对猪卵母细胞体外成熟过程中的GVBD、染色质凝集、MⅡ期成熟及卵丘细胞扩展的作用。结果表明 :( 1)培养液中添加CHX ,可抑制卵母细胞GVBD的发生 ,而且此作用是浓度依赖性的 ,但CHX的抑制效果是完全可逆的 ;( 2 )在含 10 μg/mlCHX液中分别培养 0、 6、 12和 2 4h后转入正常培养液再继续培养至 4 8h ,卵母细胞成熟率分别为 84 1%、 77 1%、 4 8 9%和 2 7 8% ;( 3 )正常培养液中培养 0、 6、 12、 2 4、 3 6和 4 8h后 ,再转入浓度为 10 μg/mlCHX液中继续培养至 4 8h ,卵母细胞成熟率分别为 0、 0、 0、 3 1 3 %、 65 4 %和 79 5 % ;( 4 )CHX对卵丘细胞扩展的影响随培养时间延长而增强 ,在CHX中处理时间为 16h或更长 ,完全抑制卵丘细胞的扩展     

β-内啡肽对妊娠早期人胎盘绒毛hCG与孕酮分泌功能的影响

实验采用庄临之等建立的人胎盘绒毛组织无血清培养方法。将妊娠7—9周人工流产的人胎盘绒毛剪成1mm左右植入培养瓶中,每瓶加入2mlMcCoy's 5a培养液培养三天,更换培养液时分别加入不同剂量(10~(-11)—10~(-7)mol/L)的β-内啡肽,继续培养24小时后收集培液,用放射免疫法测定hCG与孕酮的含量。 结果表明β-内啡肽对妊娠早期人胎盘绒毛分泌hCG     

睾酮对内皮细胞妊娠相关血浆蛋白-A mRNA表达的影响

目的:观察睾酮对内皮细胞妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)m RNA表达的影响。方法:人原代脐静脉内皮细胞,选择第3~4代生长状态良好的细胞用于实验。实验分组:1空白对照组;2肿瘤坏死因子(TNF)-α(终浓度100μg/L)培养细胞组;3TNF-α(终浓度100μg/L)及睾酮1×10-8mol/L培养细胞组;4睾酮1×10-8mol/L培养细胞组。实验结束后收集各组细胞,用RT-PCR方法检测各组细胞PAPP-A m RNA表达水平。结果:TNF-α作用2 h后,内皮细胞中PAPP-A m RNA表达水平升高(P0.05),且随TNF-α作用时间的延长,PAPP-A表达逐渐升高,在16小时达高峰;睾酮作用后,PAPP-A m RNA表达水平较TNF-α组明显降低(P0.01)。结论:TNF-α上调内皮细胞PAPP-A m RNA的表达,而睾酮抑制了TNF-α对PAPP-A分泌增加的刺激作用。     

Cu2+对离体培养猪腺垂体细胞GH分泌的影响

目的：研究铜离子（Cu2＋）对离体培养猪腺垂体细胞生长激素（GH）分泌的影响。方法：试验选取32-35日龄仔猪腺垂体细胞,于10%小牛血清的Dulbecco MEM培养液（DMEM）中离体培养48 h。之后用含不同浓度Cu2＋（0 mg/L、0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.4 mg/L、1.6 mg/L）的无小牛血清DMEM培养液培养36 h,于12 h、24 h、36 h收集细胞培养液,用Linco公司的试剂盒及放射免疫法测定培养液中GH浓度。结果：铜离子离体培养腺垂体细胞24 h,0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.4 mg/L组培养液中GH浓度均高于0 mg/L组,其中0.1 mg/L组与0 mg/L组差异显著（P〈0.05）。结论：铜离子可促进离体培养猪腺垂体细胞分泌GH。     

葡萄糖对ICR小鼠胚胎体外发育的影响

研究葡萄糖在小鼠早期胚胎体外发育中的作用。实验1将6—8周龄的ICR雌鼠超数排卵后与公鼠交配,收集1-细胞放入含0(对照组)、0.5、1、3、5、10mmol/L葡萄糖的CZB中培养;实验2将从超排的ICR雌鼠输卵管内收集的1-细胞放入无糖CZB中培养,分别于1细胞、2细胞、4细胞、桑椹胚阶段移入含3.0mmol/L葡萄糖(最适浓度)的CZB中,培养24h后又移回到无糖CZB中(桑椹胚阶段除外)继续培养以及整个胚胎培养过程均在含糖CZB中,对照组胚胎培养全程均在无糖CZB中。每组胚胎于37℃、5%CO2培养箱中培养120h,每24h在倒置显微镜下观察胚胎发育情况,分别计算2-细胞率、4-细胞率、桑椹胚率、囊胚率和孵化率,并进行囊胚细胞计数。结果显示,小鼠胚胎在含糖CZB中与在无糖CZB中4-细胞发育率无差异;含糖CZB中囊胚率显著高于对照组;3.0mmol/L浓度组囊胚细胞数显著高于其余组;2-细胞至4-细胞、4-细胞至桑椹胚前添加葡萄糖囊胚率显著高于对照组,1-细胞至2-细胞、桑椹胚及其以后阶段添加葡萄糖囊胚率与对照组无差异。实验证实,在ICR小鼠胚胎体外培养中加入葡萄糖不会导致2-细胞阻滞;葡萄糖浓度增至10mmol/L对ICR小鼠胚胎无毒性作用;ICR小鼠胚胎体外培养的最适葡萄糖浓度为3.0mmol/L;2-细胞至4-细胞、4-细胞至桑椹胚前添加葡萄糖是必要的。     

胰岛素耐受的HepG2细胞模型建立

采用高胰岛素体外诱导培养HepG2细胞,建立胰岛素耐受的细胞模型。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素培养液中24h,采用3H-D-葡萄糖掺入试验及残余125I-胰岛素结合率测定等方法观察高胰岛素对HepG2细胞葡萄糖摄取率及其胰岛素受体数目和功能的影响。高胰岛素诱导培养的HepG2细胞葡萄糖掺入率及残余125I-胰岛素结合率明显低于未用高胰岛素诱导的HepG2细胞(对照细胞)。将高胰岛素诱导培养的HepG2细胞置于不含胰岛素的培养液中60h,其细胞葡萄糖摄取率仍明显低于对照细胞。将HepG2细胞置于5×10-7mol/L胰岛素环境中24h,该细胞对胰岛素的生物学效应产生抵抗,其胰岛素抵抗状态可维持60h。     

黄芩细胞生长特性及次生代谢产物生产性能的研究

采用4种不同激素组合的MS培养液对黄芩细胞进行悬浮培养．结果表明。在各培养液中黄芩细胞的生长曲线均呈S形。培养周期仅为9d;在M2[MS 2．4-D(0．5mg／L) 6-BA(1．0mg／L)]培养液中,黄芩细胞的总黄酮积累速率、硝酸还原酶活性及过氧化氢酶活性均高于其它处理。是进行黄芩细胞悬浮培养生产总黄酮的最佳培养基配方。     

雌激素受体α抑制剂MPP对小鼠合子型基因组激活的影响可能与S期启动相关

目的观察雌激素受体α(ERα)特异性抑制剂甲基哌啶吡唑(Methyl-Piperidino-Pyrazole,MPP)对小鼠早期胚胎发育的影响与合子型基因组激活(ZGA)发生的时间是否相关,并检测与小鼠ZGA密切相关的2-细胞胚DNA复制是否受MPP处理的影响,为进一步探讨ERα在小鼠ZGA过程中的作用机制提供实验基础。方法 1收集昆明小鼠1-细胞胚、2-细胞胚和4-细胞胚,以空白KSOM培养液(单纯型优化的胚胎培养基)为对照组,以KSOM中添加MPP为实验组;将各时间点收集的早胚培养3h后再移入新KSOM培养液中继续培养至囊胚阶段,并记录囊胚数;2收集昆明小鼠末期1-细胞胚,分别置于上述两组培养液中培养15h至2-细胞胚S期后期,用荧光显微镜技术检测2-细胞胚核像变化;Brd U标记法分析DNA复制情况。结果1于不同时间段经MPP 3h处理后,在1-细胞胚末期、2-细胞早期和2-细胞胚中后期,MPP处理对小鼠早胚发育具有显著的抑制作用,其阶段特异性影响与小鼠ZGA发生的时间一致。另外,MPP对2-细胞胚G1/S过渡期(36~39h)抑制明显,但是对S期中后期(39~42h)进程无显著影响。2与KSOM组相比,经MPP处理15h后,2-细胞胚核变圆;Brd U标记水平明显下降。结论MPP在小鼠早胚中的阶段性作用与ZGA有关;ERα可能通过促进S期启动来调控ZGA。     

牛IL-2基因工程菌表达条件的研究

对重组牛IL 2基因工程大肠杆菌的摇瓶表达条件进行了研究。实验结果表明 :采用DH5α作为宿主菌 ,接种后 30℃培养 3h升温 4 2℃诱导表达 3～ 4h ,目的蛋白 (分子量 14ku左右 )表达量可达细胞总蛋白的 2 0 %～ 30 %。实验同时还确定了摇瓶发酵装液量 ,Amp浓度等关键因素。     

银杏细胞固定化培养及银杏内酯的产生

探讨利用银杏 (GinkgobilobaL .)细胞固定化培养方法 ,大规模生产药用成分银杏内酯类化合物的可能性。考察了植物生长调节剂对银杏固定化培养细胞生长及发酵液中银杏内酯类成分产生的影响。结果显示 ,最优培养基生长调节剂配比为 2 ,4 D 8 0mg L KT 0 0 4mg L NAA 0 4mg L。优化培养后 ,固定化细胞最高生物量出现在第 1 2d ,为 0 4gDW 瓶。发酵液中银杏内酯含量 :GKA在 2 2d时最高 (2 0 0 μg L) ,GKB在 1 8d时最高 (1 2 2 μg L) ,GKC在 1 8d时最高 (5 0 9μg L)。     

在中空纤维细胞培养系统内用无血清培养基生产单克隆抗体

用1640SFM无血清培养基在VF－2中空纤维细胞培养系统内培养7E8杂交瘤细胞,最大活细胞密度为2．34×10⁶／ml,该活细胞密度分别是转瓶培养和静态瓶培养结果的3．7倍和2．2倍。培养42天共收获7E8细胞培养液10000ml,其单克隆抗体(简称单抗)的ELIsA效价为1:20000左右,该效价是转瓶培养和静态瓶培养结果的25倍。ID。0mI培养液经50％饱和硫酸铵盐析和sephadex G-200柱层析提纯,获纯化单抗IgG 51．82mg。该系统平均每天生产单抗12．3mg。研究结果表明;在中空纤维培养系统内用无血清培养基培养杂交瘤细胞的方法可望用于体外大规模生产单抗。     

长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存研究

对长鞭红景天悬浮培养细胞的玻璃化法超低温保存进行了初步研究.结果表明,预培养、预处理、脱水处理及冻后处理对长鞭红景天悬浮培养细胞存活率均有重要影响,方差分析结果均显示差异显著.长鞭红景天悬浮培养细胞过程中最佳培养条件是:在含5%二甲基亚砜(DMSO)的MS培养基上预培养1 h,室温下80%PVS2预处理40 min,然后用100%PVS2于0℃处理50 min,投入液氮(LN)保存1 h后在40℃水浴中迅速化冻,再用1.2 mol/L蔗糖培养液洗涤3次,每次10 min,洗涤后的悬浮培养细胞用氯化三苯四氮唑(TTC)法检测,其存活率可达72.70%.     

内皮素-1预处理对培养乳鼠心肌细胞低氧损伤的保护作用

实验观察了 0 0 1- 1nmol/L内皮素 1(ET 1)预处理对低氧孵育 ( 3 %O2 5 %CO2 ,12h)的培养乳鼠心肌细胞乳酸脱氢酶 (LDH)释放量、培养液上清超氧化物歧化酶 (SOD)活性以及丙二醛 (MDA)含量的影响。用Fluo 3 /AM负载培养的心肌细胞 ,在激光扫描共聚焦显微镜下监测急性低氧的心肌细胞 [Ca2 +]i 的变化和ET 1预处理对低氧所致 [Ca2 +]i 变化的影响。结果如下 :( 1)心肌细胞低氧孵育 12h后 ,培养液上清LDH活力和MDA含量较常氧对照组明显升高 ,分别为 43 3 3± 1 2 1U/Lvs 19 3 3± 1 0 3U/L和 1 71± 0 0 2nmol/Lvs 0 91± 0 0 3nmol/L (P<0 0 1) ,SOD活性为 16 93± 1 11U/ml明显低于常氧对照组的 3 3 48± 1 15U/ml (P <0 0 1) ;0 0 1- 1nmol/LET 1预处理呈浓度依赖性抑制低氧培养心肌细胞LDH释放 ,减少培养液上清MDA含量、提高SOD活性 (P <0 0 1)。 ( 2 )低氧灌流后 2 9± 1 5s (n =2 3 )心肌细胞自发性钙瞬变完全终止 ,[Ca2 +]i 升高了 10 7± 13 2 % (P <0 0 0 1) ;0 0 1- 1nmol/LET 1能明显加快心肌细胞钙瞬变的频率 (P <0 0 1) ;ET 1预处理后低氧所致钙瞬变终止的时间较单纯低氧组明显推迟 ,[Ca2 +]i过度升高被明显减轻 (P <0 0 1)。上述结果表明 ,0 0 1- 1nmol/LET 1预处理可减轻培     

毕赤酵母高密度表达重组猪胰岛素前体的研究

对摇瓶和50L罐上的重组菌毕赤酵母(Pichia pastoris)表达猪胰岛素前体(PIP)的发酵过程进行了研究。摇瓶发酵中,最佳诱导周期为60 h左右,诱导期甲醇的最佳加入量为每日2．0%～2．5%。50L发酵过程分为批发酵、补料和诱导表达3个阶段。生长期(批发酵和补料阶段)细胞干重与培养时间的关系可用模型y= 0．6525e~(0．1909t)来描述。在批发酵阶段和补料阶段,流加的氨水和甘油几乎全部用来合成菌体和维持,没有其他副产物产生。诱导表达阶段流加的氨水和甲醇分别约有80%和70%被菌体利用。将摇瓶与发酵罐的实验结果进行了比较,发现摇瓶发酵的限制因子很可能是溶氧,而罐发酵的限制因子为碳源,因此,将摇瓶实验的结果放大到发酵罐时调整了控制策略,加大了甲醇的补料速率,最终PIP浓度达到1．72g/L。     

PEG诱导人类细胞和元麦原生质体融合初步尝试

本实验尝试以PEG诱导Hela细胞与元麦原生质体融合进行了初步观察。 实验方法是将Hela细胞悬液250万/0.25 ml和元麦原生质体悬浮液500万/0.25 ml混合,然后加入0.125 ml PEG溶液(PEG 6,000分子量0.09M,CaCl_2·2 H_2O 10.5 mM,葡萄糖0.25 M,KH_2PO_4·7H_2O 0.7mM,pH 5.5)于37℃孵育30分钟,接着以RPMI-1640培养液洗掉PEG,离心收集细胞培养于小玻瓶中。实验分两组:一组细胞培养在Nagata培养液中,另一组培养在RPMI-1640培养液中。初步观察结果如下:     

热带普通小球藻培养模式的筛选及其培养基的优化

【背景】从海南热带海区中分离得到一株微藻,其生长速度快、适应力强,经鉴定该微藻为普通小球藻。【目的】提高热带普通小球藻的生长速率。【方法】以"宁波大学3#微藻培养液配方"为基础培养液,分别添加有机碳(C6H12O6和CH3COONa)对热带普通小球藻进行自养、兼养及异养培养,获得促进热带普通小球藻快速生长的培养方式。在"宁波大学3#微藻培养液配方"的基础上对热带普通小球藻的兼养培养基配方进行优化,并用优化兼养培养基与"宁波大学3#微藻培养基"对比培养热带普通小球藻。【结果】添加6 g/L CH3COONa的兼养模式促进热带普通小球藻生长效果最好;优化的兼养培养基配方为:6 g/L CH3COONa,20 mg/L(NH4)2SO4-N,5 mg/L Na H2PO4-P,3 mg/L Fe SO4-Fe,1 mg/L Vitamin B1和0.000 5 mg/L Vitamin B12。对比培养实验结果显示,培养第6天,兼养培养液收获的生物量(细胞密度)达4.20×107 cells/m L,是"宁波大学3#配方微藻培养液"的2.30倍。【结论】兼养培养模式为热带普通小球藻的最佳培养模式,优化的兼养培养基极显著地提高了热带普通小球藻的生物量(P0.01)。