高表达精脒/精胺N1-乙酞基转移酶对人肺癌A549细胞株生长的影响

旨在研究人精脒/精胺N1-乙酰基转移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase,SSAT)高表达对人肺癌A549细胞生长的影响。以pCR2.1-SSAT质粒为模板,PCR法扩增人SSAT基因并克隆至pcDNA3.1表达载体。重组质粒转染A549细胞后,RT-PCR法和Western blotting法筛选SSAT高表达的细胞株。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。成功构建pcDNA3.1-SSAT重组质粒,用该质粒转染A549细胞后,筛选获得稳定高表达SSAT的细胞株。SSAT高表达导致细胞生长抑制,S期细胞减少和自发性凋亡细胞增多。结果显示,稳定高表达SSAT可在A549肺癌细胞中部分模拟多胺类似物类抗癌药物的药理活性,导致瘤细胞生长抑制和细胞凋亡。     

MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro（＋）质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞中,潮霉素筛选稳定转染克隆,通过MTT实验,研究转染MEKK3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误,Western印迹检测结果显示MEKK3基因在A549细胞中具有良好的表达;荧光实时定量PCR结果表明MEKK3基因在其稳定转染的A549细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT结果显示MEKK3表达上调的稳定克隆组,A549细胞的增殖活性显著增强（A570=0.876 1±0.074 5）,明显高于空载体稳定转染组（A570=0.582 8±0.070 3）及未转染亲代细胞组（A570=0.584 9±0.035 2）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 MEKK3表达上调可导致肺腺癌细胞的增殖增强.     

IFI16基因外来表达对喉癌细胞Hep-2的影响

将RT-PCR扩增得到的IFI16基因构建到真核表达质粒pVR1012中,得到pVR1012-IFI16重组质粒,用脂质体将其转染导入Hep-2细胞。半定量RT-PCR及Western blot检测IFI16基因在Hep-2细胞中的外来表达情况,细胞生长曲线绘制法及MTT法测定IFI16基因外来表达对Hep-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测IFI16基因外来表达对Hep-2细胞周期及凋亡的影响。半定量RT-PCR分析结果发现,pVR1012-IFI16重组质粒转染的Hep-2细胞IFI16基因mRNA水平显著升高;Western blot分析结果发现,pVR1012-IFI16重组质粒转染的Hep-2细胞IFI16基因蛋白质表达水平显著升高;细胞生长曲线测定结果发现,第2天开始pVR1012-IFI16重组质粒转染的Hep-2细胞生长变慢,至第3天时pVR1012-IFI16重组质粒转染的Hep-2细胞生长速度明显变慢,与mock转染及空载体转染对照细胞相比差异显著（P〈0.05）;MTT测定结果发现,pVR1012-IFI16重组质粒转染Hep-2细胞48 h后,其相对活细胞数目显著降低,与mock转染及空载体转染对照细胞相比差异十分显著（P〈0.01）;流式细胞术检测结果发现,与mock转染及空载体转染对照细胞相比,pVR1012-IFI16重组质粒转染48 h后Hep-2细胞亚G0期细胞比例以及凋亡细胞比例都显著升高。上述研究结果说明,构建得到的pVR1012-IFI16重组质粒能在Hep-2细胞中外来表达IFI16基因,IFI16基因外来表达抑制Hep-2细胞增殖、阻滞Hep-2细胞周期在亚G0期并诱导Hep-2细胞发生凋亡。     

肿瘤特异的sea基因真核表达质粒的构建及在肺癌细胞中的功能研究

构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核表达质粒,检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达以及表达产物的超抗原活性.以PCR法扩增sea基因,以含有Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒为基础,构建pGL-S-SEA真核表达质粒.用脂质体转染A549细胞,以RT-PCR法检测sea基因表达水平.制备健康献血者PBMC,用pGL-S-SEA质粒转染A549细胞的上清液和细胞裂解液进行PBMC刺激试验,以MTT法检测其促细胞增殖效应.结果显示,成功构建Survivin启动子调控的真核表达质粒pGL-S-SEA.重组质粒在A549细胞中启动了sea基因的表达,其转录强度为内参(GADPH基因)的65.96%,在对照MRC-5细胞中无明显表达.该质粒转化A549细胞的裂解液具有促进人PBMC增殖活性、上清液无明显促PBMC增殖作用,裂解液组、上清液组和PHA阳性对照组的刺激指数分别为1.29、0.95和1.58.结论成功构建pGL-S-SEA质粒,其在A549细胞的表达产物具有诱导人PBMC增殖的超抗原活性,为下一步将其作为基因疫苗治疗肺癌奠定了基础.     

雌激素对肺腺癌细胞系A549中NOK表达量的影响

目的:探讨雌激素对肺腺癌细胞系A549中NOK基因表达的影响,为研究雌激素与NOK基因在非小细胞肺癌转移中的作用提供参考依据。方法:用MTT法绘制肺腺癌细胞系A549的生长曲线,确定A549的指数增长期;用浓度梯度为1×10~(-10)-1×10~(-6)mol/L的雌激素在指数增长期刺激细胞,12 h后换液,24 h后提取总RNA及总蛋白,用q-RT-PCR及Western-blot检测各组细胞中NOK表达量。结果:A549细胞系的指数增长期为第3天;雌激素刺激细胞之后,NOK表达量普遍增高,低浓度时,NOK表达量随雌激素浓度增高而增高,高浓度时,NOK表达量随雌激素浓度增高而降低,但依然高于正常水平,组间有统计学差异,其中,当浓度为1×10~(-8)mol/L时,NOK表达量最高。结论:雌激素在一定浓度范围内可以促进肺腺癌细胞系A549中NOK基因的表达。     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

脂质体介导的人甲状腺过氧化物酶基因转染肺癌A549细胞及其蛋白表达

目的:利用基因转染技术,研究以脂质体Lipofectamine2000为载体介导的人甲状腺过氧化物酶(TPO)基因体外转染肺癌细胞,检测感染细胞内TPO蛋白的表达,为放射性碘治疗肺癌提供理论和实验依据.方法:将获得的含TPO基因的质粒pcDAN3.1-hTPO进行扩增、纯化,并经酶切鉴定和DNA测序.将肺癌A549细胞在体外复苏与培养并分为两组:转染质粒peDAN3.1-hTPO的为实验组,转染空质粒pcDAN3.1的为对照组.以脂质体Lipofectamine2000为栽体,介导TPO基因转染肺癌细胞.采用Western Blot免疫印迹法和免疫组化法分别检测肺癌细胞中TPO蛋白的表达.结果:①酶切鉴定和DNA测序结果表明质粒pcDAN3.1-hTPO中插入的基因为hTPO基因,其片段大小和方向正确.②体外培养的肺癌细胞活力及数量正常,细胞活力为96%,细胞生长密度为1× 106/ml,满足实验要求.③质粒转染A549细胞后,Western Blot免疫印迹法显示:在实验组中,肺癌A549细胞有TPO蛋白的表达,而在对照组中无表达.④免疫组化染色结果显示:在实验组的肺癌A549细胞中,TPO蛋白表达阳性且主要分布于细胞膜上,阳性表达率可达75%,而在对照组中TPO蛋白表达阴性,两组比较差异有显著性(P=0.000).结论:①获得的hTPO基因片段的核苷酸序列与GeneBank报道完全一致.②在脂质体Lipofectamine2000的介导下,TPO基因能够有效地转染肺癌细胞.③转染人甲状腺过氧化物酶基因的肺癌细胞能够在体外成功地表达TPO蛋白.     

TFPI-2对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及AFP合成的影响

目的: 探讨TFPI-2基因对人肝癌细胞Hep3B生长增殖、凋亡及甲胎蛋白AFP表达的影响。 方法: 将重组质粒PCDNA3.1-TFPI-2转染Hep3B细胞并经G418稳定筛选后,RT-PCR和Western blot检测转染前后TFPI-2 mRNA和蛋白表达水平,采用CCK-8法、生长曲线观察TFPI-2对人肝癌细胞Hep3B生长增殖的影响,通过平板克隆形成实验观察单个细胞的增殖能力,RT-PCR检测AFP mRNA的表达,并用电化学发光法测定培养上清液中甲胎蛋白AFP含量,流式细胞仪检测细胞早晚期凋亡情况。 结果: 转染成功的Hep3B细胞检测到TFPI-2 mRNA和蛋白的表达;与转染空载体及未转染的细胞相比,转染TFPI-2的细胞生长增殖能力明显减弱;AFP mRNA表达抑制率为16.51%,AFP蛋白分泌明显低于对照组(P<0.01);流式细胞术检测转染TFPI-2的Hep3B细胞早期凋亡率明显增加(24.03%±7.28% vs 8.77%±3.66%)。 结论: TFPI-2表达可显著抑制肝癌细胞生长和AFP的表达,同时还能诱导细胞早期凋亡。为进一步探讨靶向TFPI-2的肝癌基因治疗提供了实验依据。     

Napsin A基因对A549细胞在上皮-间质转化中增殖的影响及其机制

采用慢病毒载体质粒PLJM1将NapsinA基因转染到人肺腺癌细胞——A549细胞中,获得稳定表达Napsin A蛋白的特性并鉴定,通过转化生长因子-β1刺激A549细胞发生上皮-间质转化,体外构建上皮-间质转化模型并鉴定。MTT法检测转基因前后A549细胞在上皮-间质转化过程中生长速率的变化;流式细胞术检测其细胞周期的改变,最后予Western blot检测黏着斑激酶的表达情况,探讨Napsin A基因对A549细胞在上皮-间质转化过程中增殖的影响及其机制。结果表明转染后的A549细胞表达Napsin A蛋白明显增加(P<0.01);A549细胞发生上皮-间质转化后细胞E钙蛋白表达下调(P<0.01),Ⅰ型胶原表达上调(P<0.01);转基因细胞在体外上皮-间质转化模型中增殖速度减慢(P<0.05),且细胞周期被阻滞在G_1期(P<0.01),其表达整合素信号传导通路的基础分子——黏着斑激酶的量显著下降(P<0.01)。提示Napsin A基因可以抑制A549细胞在上皮-间质转化过程中的进一步增殖,其机制可能与抑制整合素信号传导通路有关。     

转录因子WSTF对肺癌细胞增殖和侵袭的实验研究

目的:研究转录因子WSTF对肺癌细胞增殖和侵袭作用的影响。方法:采用慢病毒介导的基因转染方法建立A549细胞WSTF高表达细胞系A549-WSTF和空质粒对照细胞系A549-control。细胞增殖实验和克隆形成实验观察ING5过表达对肺癌A549细胞增殖能力的影响;Trans-well迁移实验和侵袭实验观察WSTF对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:Western blot验证A549-WSTF细胞WSTF蛋白水平显著高于对照细胞A549-control,P=0.0004。WSTF高表达明显促进了肺癌细胞的增殖能力(1-4天P值分别为0.002、0.0004、0.0002和3.21×10-5)和克隆形成能力(P=0.004);WSTF过表达还显著促进了肺癌细胞从trans-well小室迁移到下室的作用,其OD570值分别为0.626±0.013(A549-WSTF)和0.322±0.010(A549-control),P=2.37×10-5;WSTF还促进肺癌细胞穿透基质胶迁移到下室,其OD570值分别为0.600±0.027(A549-WSTF)和0.333±0.017(A549-control),P=0.0004。结论:WSTF可以促进肺癌细胞的增殖和侵袭能力而发挥促癌作用。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.