mtCOI PCR-RFLP技术鉴别中国入侵型和土著型烟粉虱种群的有效性分析

烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)是世界范围内最重要的入侵生物之一,准确地鉴别烟粉虱入侵生物型和土著生物型具有十分重要的现实意义。mtCOI PCR-RFLP技术具有快速、高效的特点,是当前应用最广泛的烟粉虱生物型鉴定技术,但是,不同限制性内切酶为基础的mtCOI PCR-RFLP技术在鉴定我国烟粉虱种群中的有效性仍不明了。本文比较了已报导的5种mtCOI PCR-RFLP技术在鉴别中国烟粉虱种群入侵生物型和土著生物型(B型、Q型,ZHJ1型、ZHJ2型、ZHJ3型)的有效性。结果表明,内切酶AluI不能区分B型和ZHJ2型烟粉虱;内切酶TaqI不能准确区分ZHJ3型和Q型烟粉虱个体;而内切酶VspI不仅不能准确区分ZHJ1型和Q型烟粉虱个体,也不能准确区分B型和ZHJ2型烟粉虱;内切酶MseI和Tru9I则不能有效鉴别上述5种烟粉虱生物型,因此不适宜推广使用。     

烟粉虱Q与B隐种mtCOI基因的遗传变异及其对利用CAPS标记进行隐种鉴别的影响

【目的】为了评估VspI,StyI和StuI为基础的线粒体细胞色素氧化酶I基因（mtCOI）酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)标记方法鉴别烟粉虱Q与B隐种的有效性。【方法】本研究对国内外烟粉虱种群的mtCOI基因进行了测序并鉴定了其隐种;在对464个Q隐种、98个B隐种mtCOI序列分析的基础上,利用VspI,StyI和StuI对Q与B隐种分别进行了CAPS标记验证。检索并比对了GenBank中烟粉虱Q与B隐种mtCOI序列中VspI,StyI和Stu I酶切位点分布情况。【结果】对国内外烟粉虱种群研究发现,以Vsp I为基础的CAPS标记方法能够有效鉴别实验中的Q与B隐种;利用StuI或StyI的CAPS标记方法无法有效鉴别Q与B隐种。对GenBank中烟粉虱Q与B隐种mtCOI序列比对发现,利用VspI,StyI和StuI为基础的CAPS标记方法不能有效鉴别Q与B隐种。【结论】以VspI,StyI和StuI为基础的CAPS标记方法鉴别Q与B隐种方面均有一定的局限性。     

微卫星位点BEM06与BEM23鉴别烟粉虱B型与Q型的有效性

烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) B型与Q型是烟粉虱复合种中入侵性较强、分布较广的2种生物型, 当前在许多地区混合发生。这2种生物型的快速鉴别对其种群动态调查及入侵生态学研究具有重要价值。为了验证微卫星位点BEM06与BEM23鉴别B型与Q型烟粉虱的有效性, 本研究分析了这2个微卫星位点的等位基因在国内外17个B型、4个Q型、3个非B/Q型烟粉虱种群的分布特点。结果表明: 这2个微卫星位点的联合使用可鉴别B型与Q型烟粉虱, 但是无法有效地将B型、Q型与一些非B/Q型烟粉虱某些个体区分开来。结果提示: 利用微卫星位点BEM06与BEM23鉴别B型与Q型烟粉虱具有一定的局限性, 尤其是田间烟粉虱存在其他生物型时需要慎重使用这种鉴别方法。     

温室粉虱和烟粉虱3个隐种中热激蛋白基因hsp70和hsp90含量的比较分析

【目的】昆虫适应新环境的能力与其对温度的耐受能力密切相关。热激蛋白HSP70和HSP90具有提高生物体温度耐受性的功能。烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)不同隐种和不同种粉虱对温度的适应能力有差异,这与它们的热激蛋白基因拷贝数的差异可能相关。【方法】利用实时荧光定量PCR方法,检测入侵型烟粉虱MED隐种和MEAM1隐种、本地型烟粉虱AsiaⅡ1隐种以及温室粉虱Trialeurodes vaporariorum (Westwood)基因组DNA中热激蛋白基因hsp70和hsp90的拷贝数。【结果】不同种类的粉虱和烟粉虱不同隐种体内的hsp70和hsp90的含量均有较大差异,其中hsp70和hsp90拷贝数在入侵型烟粉虱MED和MEAM1隐种中含量较其他两种均高,而在土著种AsiaⅡ1隐种中含量最低,在温室粉虱中居中。此外,相同物种雌雄成虫hsp70和hsp90的拷贝数也不同,雌虫hsp70和hsp90拷贝数约为雄虫的2倍。【结论】不同种粉虱及烟粉虱不同隐种的hsp70和hsp90的拷贝数可能与其耐热性差异相关。本研究为解释不同种粉虱、烟粉虱不同隐种及其不同性别的耐热性差异机制提供了进一步的依据。     

Q型烟粉虱东地中海种群遗传多样性的mtCOI与SSR分析

前期研究表明入侵我国山东的Q型烟粉虱Bemisia tabaci（Genn.）种群来源于西地中海地区而非来源于东地中海地区。为了揭示Q型烟粉虱的入侵遗传机制, 本研究进一步利用线粒体COI（mtCOI）基因与6个具有多态性的微卫星位点（SSR）分析了东地中海Q型烟粉虱（Q1支系与Q2支系）种群的遗传多样性, 并与西地中海种群遗传多样性的前期研究结果进行了比较分析。基于mtCOI基因与微卫星标记分析结果表明, 东地中海种群与西地中海种群一样也具有较高的遗传多样性, 然而两个地区种群存在着遗传异质性。不同入侵性种群遗传结构的比较研究将为进一步解析外来种群的入侵生理生态机制奠定基础。     

南方部分地区烟粉虱及其寄生蜂内共生菌Cardinium的检测及其系统发育关系

【目的】研究我国南方四个省份6个烟粉虱Bemisia tabaci种群和2个蚜小蜂种群内共生菌Cardinium的感染率及其系统发育关系。【方法】利用PCR技术与DNA测序技术检测来自广州、肇庆、南宁、昆明、厦门烟粉虱种群以及广州2个蚜小蜂种群内Cardinium的感染情况,通过基于mt COⅠDNA序列和16S r RNA序列建立烟粉虱和Cardinium系统进化树,分析烟粉虱、寄生蜂和共生菌Cardinium的协同进化关系。【结果】广州的Asia II1与Asia II7烟粉虱种群、肇庆与南宁的MEAM1烟粉虱种群、昆明与厦门的Mediterranean烟粉虱种群以及广州的丽蚜小蜂Encarsia formosa、双斑蚜小蜂Encarsia bimaculata种群体内都有Cardinium的感染,且以Mediterranean与土著的Asia II1、Asia II7感染率较高(65.2%~92.5%),寄生蜂体内的感染率较低(16.7%~18.6%)。通过进化树对比分析发现,Cardinium与烟粉虱寄主之间无协同进化现象,但是Cardinium在烟粉虱不同地理种群之间,烟粉虱与寄生蜂之间的同源性超过98%。【结论】Cardinium在两种寄主昆虫之间进行相互感染与传播的概率较大,寄生蜂可能是Cardinium在不同烟粉虱种群之间水平传播的桥梁之一。     

田间系统调查表明山东省农区烟粉虱优势种为Q隐种

【目的】为了揭示山东省农区烟粉虱 Bemisia tabaci 隐种的分布情况,对2013年7-8月份期间在该省不同农区采集的烟粉虱隐种组成进行了系统调查研究。【方法】在山东省15市22个地点作物上采集了69份烟粉虱样品,利用mtCOI基因PCR-RFLP方法进行了分子鉴定,并分析了烟粉虱Q隐种在不同寄主作物及地理区域内的分布状况。【结果】22个采集地点中,17个地点的采集样品全部为烟粉虱Q隐种;其他5个地点（潍坊、菏泽、泰安、淄博和临沂）的烟粉虱Q隐种所占比例均大于90%,B隐种比例较低（<10%）。烟粉虱Q隐种比例在5种寄主（茄子、辣椒、番茄、黄瓜和棉花）种群间以及在山东省东部丘陵、中部山地和西部平原地区间均没有显著差异。【结论】2013年田间调查发现烟粉虱Q隐种在山东各地已广泛取代B隐种成为该地区优势种群。     

烟粉虱的分类地位及在中国的分布

烟粉虱广泛分布于全球热带和亚热带地区。近20多年,烟粉虱的一些遗传群入侵世界各地,严重危害作物生产。烟粉虱遗传结构的多样性和复杂性早已被关注,但其分类地位,尤其是烟粉虱到底是一个包含多个生物型的种还是一个包含许多隐种的物种复合体,一直颇受争议。近几年,有关烟粉虱种系发生和系统学的研究取得长足进展,有证据推论其是一个包含至少31个隐种的物种复合体,但生殖隔离证据仍显不足,种系发生分析结果也因仅依据COI一个基因而受到质疑。因此,在大多数从事烟粉虱研究的同行接受其为一个物种复合体的概念的同时,仍有同行沿用生物型的概念。在我国境内已先后报道了包括13个本地种和2个全球入侵种在内的15个烟粉虱隐种。本地种主要分布在我国南部及包括海南岛和台湾岛的东南沿海地区,隐种的多样性由南向北逐渐降低。入侵种“中东一小亚细亚1”隐种（MEAMl）（即“B型”）和“地中海”隐种（MED）（即“Q型”）分别于20世纪90年代中后期和2003年前后入侵我国,并在许多地区迅速取代了本地种而占据优势地位。全国范围内的调查数据显示,这2个入侵种可在大部分区域共同存在,但自2005年以来,MED在许多地区陆续取代MEAMl,这很可能与MED对大量使用的新烟碱类杀虫剂有较强抗性有关。本文还讨论了烟粉虱隐种复合体分类所面临的命名等难题以及大范围抽样调查的数据偏差问题。     

海南烟粉虱田间种群隐种鉴定及对溴氰虫酰胺和氟吡呋喃酮的敏感性检测

【目的】明确海南烟粉虱Bemisia tabaci田间种群对2种新型杀虫剂溴氰虫酰胺和氟吡呋喃酮的敏感水平,为杀虫剂的合理施用与烟粉虱的田间抗性监测提供参考。【方法】以2017年1月采自海南省6个地点烟粉虱田间种群为材料,利用线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因(mtCOI)测序及mtCOI PCR-RFLP分子标记对采集种群隐种进行鉴定;采用浸叶法测定溴氰虫酰胺和氟吡呋喃酮2种药剂对各地区田间种群的致死中浓度(LC_(50))。【结果】在海南省6个烟粉虱田间种群中,三亚市吉阳区种群为MEAM1隐种,澄迈县永发镇种群和乐东黎族自治县冲坡镇种群以MED隐种为主的MEAM1(10%)与MED隐种(分别为94.6%和92.9%)混合种群,其他3个田间种群均为MED隐种。与溴氰虫酰胺敏感种群相比,除乐东黎族自治县十所种群已处于低水平抗性(RR:5~10倍),其他5个种群均处于敏感水平(RR5倍);所有6个田间种群对氟吡呋喃酮均处于敏感水平(RR3倍)。【结论】溴氰虫酰胺和氟吡呋喃酮可作为烟粉虱防控的新药剂,并可作为其抗性治理的替代药剂,但同时应密切关注烟粉虱对溴氰虫酰胺抗性水平变化情况。     

烟粉虱MED隐种抑制蛋白基因Btarrestin的克隆及特性分析

【目的】明确烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种抑制蛋白基因Btarrestin是否参与吡虫啉耐药性。【方法】根据已有烟粉虱转录组数据,利用RT-PCR克隆Btarrestin的全长序列,进行生物信息学分析。通过qPCR分析Btarrestin在烟粉虱MED隐种各个龄期(卵,1-2龄、3龄、4龄若虫,雌、雄成虫)以及吡虫啉处理(100 mg/L)后成虫中的表达量变化,明确其时空表达模式。利用RNAi技术沉默Btarrestin,观察沉默前后Btarrestin表达量和烟粉虱MED隐种成虫死亡率变化。【结果】成功克隆烟粉虱MED隐种Btarrestin的cDNA序列(GenBank登录号: MK204377),编码区全长1 227 bp,编码409个氨基酸,预测所编码的蛋白分子量约为45.33 kD,理论等电点(pI)为8.38。保守结构域分析表明,Btarrestin具有Arrestin_N和Arrestin_C两个超家族保守结构域,符合抑制蛋白家族特征。分子系统树分析表明,Btarrestin与褐飞虱Nilaparvata lugens的Arrestin亲缘关系最近。Btarrestin的表达量随烟粉虱MED隐种的生长发育逐渐升高,成虫期表达量最高。100 mg/L吡虫啉处理成虫24 h后Btarrestin的表达量较对照增加了2.39倍。RNAi干扰Btarrestin后进行生物测定,烟粉虱MED隐种成虫的死亡率上升了31.27％。【结论】Btarrestin可能与烟粉虱MED隐种对吡虫啉的耐药性有关。     

利用TaqMan等位基因技术鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种

MEAM1和MED是烟粉虱Bemisia tabaci两种重要的外来入侵隐种, 在我国部分地区常混合发生, 对我国农业生产造成了不同程度的危害和损失。尤其是MED隐种危害寄主范围更广, 对多种杀虫剂具有较高抗性, 防治上更为困难。因此, 如何快速鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种, 对于烟粉虱防治策略的选择具有十分重要的意义。本研究选择线粒体细胞色素氧化酶I(mitochondrial cytochrome oxidase I, mtDNA COI)基因保守区域内的单核苷酸多态性（SNP）为靶标, 应用等位基因聚合酶链式反应技术, 借助TaqMan-MGB荧光染色标记探针, 建立了一种鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种的等位基因选择性PCR方法, 并对北京11个区县的14个烟粉虱种群进行了隐种鉴定。结果表明, 北京地区14个烟粉虱种群样本与已知烟粉虱MED隐种种群在荧光值分布上聚为一簇, 为MED隐种。该鉴定方法具备SNP基因分型的优点, 可快速、 可靠、 高通量地鉴定烟粉虱MEAM1和MED, 为烟粉虱隐种鉴定及遗传分化研究提供了新的可选途径。     

Q型烟粉虱在中国的入侵生态过程及机制

外来种的入侵生态过程及机制是入侵生物学重要的研究内容, 相关领域的案例分析对入侵生物学学科构建具有重要的理论意义, 对于入侵生物的防控具有重要的实践价值。但迄今中国对外来种的入侵生态过程及机制案例分析较少。而近10年来中国学者对重大入侵昆虫Q型烟粉虱Bemisia tabaci的研究为这方面的分析提供了可能。基于上述因素, 本文以Q型烟粉虱为例, 追溯了Q型烟粉虱成功入侵中国的生态过程, 总结了该昆虫成功入侵的生态过程特征, 从种群遗传结构、 生态因子及人类活动等方面解析了该虫成功入侵的机制, 展望了Q型烟粉虱入侵生物学未来的研究方向。我们认为, Q型在中国的入侵生态过程具有传入隐蔽、 扩散快速、 危害严重等特点; Q型烟粉虱成功入侵中国涉及Q型烟粉虱种群遗传学基础、 生态因子及人类活动等多种因素, 其中杀虫剂在中国的大量使用对Q型取代B型的驱动作用可能是Q型烟粉虱在中国成功入侵的重要因素。     

基于种特异性COI标记的新入侵种甘蓝粉虱快速鉴定技术

【目的】针对粉虱类害虫种类多、体型微小、形态相似、难以准确快速识别的问题,以新入侵我国大陆的甘蓝粉虱 Aleyrodes proletella (L.)为靶标,以田间常见的其他10种/隐种粉虱为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I (mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I, mtDNA COI) 基因的种特异性 (species-specific COI, SS-COI) PCR方法,研究其快速分子检测技术。【方法】利用mtDNA COI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198获得甘蓝粉虱及其他常见粉虱的COI序列,根据测序结果设计种特异性SS-COI引物1对（APZYJF/APZYJR）,其扩增片段大小为384 bp,同时对该对引物的种特异性及灵敏性进行检测。【结果】种特异性检验结果显示,该对引物仅对甘蓝粉虱的mtDNA COI基因具有扩增效果,对我国常见的其他种类的粉虱包括温室粉虱 Trialeurodes vaporariorum (Westwood)、柑橘粉虱 Dialeurodes citri (Ashmead)、螺旋粉虱 Aleurodicus disperses (Russell)、双钩巢粉虱 Paraleyrodes pseudonaranjae Martin、非洲伯粉虱 Bemisia afer (Priesner et Hosny)以及烟粉虱B. tabaci (Gennadius)5个隐种（MED, Asia I, Asia II 1, Asia II 3和China 1）等不具有交叉反应扩增能力。灵敏性检验结果显示,该对引物不仅对不同性别的成虫具有良好的扩增效能,对2-4龄若虫甚至单粒卵或单头初孵若虫亦具有同样的扩增能力,其最低检测阈值为14.00±0.37 pg/μL（相当于1/25 600头雌性成虫）。【结论】该技术体系完全可用于甘蓝粉虱的快速准确识别及检测监测,对有效阻截其进一步扩张蔓延意义重大。     

Crossing experiments and behavioral observations reveal reproductive incompatibility among three putative species of the whitefly Bemisia tabaci

Abstract The whitefly Bemisia tabaci has a global distribution and extensive genetic diversity. Recent phylogenetic analyses as well as crossing experiments suggest that B. tabaci is a complex composed of > 20 cryptic species, but more crossing studies are required to examine the reproductive compatibility among the putative species and thus further clarify the systematics of this species complex. We conducted crossing experiments and behavioral observations to investigate the reproductive compatibility between the Mediterranean, Asia II 3, and Asia II 1 putative species of B. tabaci collected from Zhejiang, China. Female progeny were never produced in inter-species crosses, demonstrating a lack of egg fertilization; while 55%–75% females were produced in all the intra-species treatments. Continuous behavioral observations showed that frequent courtship events occurred in both intra-species treatments and inter-putative species crosses. However, copulation events occurred only in the three intra-species treatments with one exception: that one copulation event occurred between Asia II 3 and Mediterranean in the crosses where two cohorts of females and males of different putative species were enclosed together in a small arena but were not allowed access to their intra-specific mates for a long period of time. These data demonstrated complete reproductive isolation between the Mediterranean, Asia II 3, and Asia II 1 putative species, and further showed that the isolation is due to lack of copulation. Demonstration of reproductive isolation between the Mediterranean and two indigenous putative species from China provides further evidence for the existence of cryptic species within the B. tabaci complex.     

Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci

Abstract Endosymbionts are important components of arthropod biology. The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) is a cryptic species complex composed of ≥ 28 putative species. In addition to the primary endosymbiont Portiera aleyrodidarum, six secondary endosymbionts (S‐endosymbionts), Hamiltonella, Rickettsia, Wolbachia, Cardinium, Arsenophonus and Fritschea, have been identified in B. tabaci thus far. Here, we tested five of the six S‐endosymbiont lineages (excluding Fritschea) from 340 whitely individuals representing six putative species from China. Hamiltonella was detected only in the two exotic invaders, Middle East‐Asia Minor 1 (MEAM1) and Mediterranean (MED). Rickettsia was absent in Asia II 1 and MED, scarce in Asia II 3 (13%), but abundant in Asia II 7 (63.2%), China 1 (84.7%) and MEAM1 (100%). Wolbachia, Cardinium and Arsenophonus were absent in the invasive MEAM1 and MED but mostly abundant in the native putative species. Furthermore, phylogenetic analyses revealed that some S‐endosymbionts have several clades and different B. tabaci putative species can harbor different clades of a given S‐endosymbiont, demonstrating further the complexity of S‐endosymbionts in B. tabaci. All together, our results demonstrate the variation and diversity of S‐endosymbionts in different putative species of B. tabaci, especially between invasive and native whiteflies.