神经元活动控制胼胝体纤维投射模式的研究取得新进展

2007年10月17日,Journal of Neuroscience杂志在线发表了中科院上海生科院神经所丁玉强研究员课题组关于神经元活动控制胼胝体纤维投射模式的最新研究成果。 胼胝体是脑内最大的联合系统,由两侧大脑皮层锥体细胞发出的轴突集合而成,负责两侧大脑半球之间的信息交换。一个重要的问题是：从一侧大脑皮层发出的胼胝体纤维是以怎样的方式投射到对侧皮层？这种投射模式是受哪些因素调控的？     

N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移

在大脑皮层发育过程中,神经元迁移是一个动态的复杂过程,与细胞骨架构建和重塑的调控息息相关。N-WASP蛋白是Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族(WASP-WAVE family)的一个重要成员,又名WAS-like蛋白(WASL),直接参与细胞骨架中肌动蛋白丝状分支的动态调控。本研究通过蛋白免疫印迹检测发现N-WASP表达于小鼠胚胎发育时期(E12.5~E18.5)的大脑皮层中,并且其表达水平随着发育逐渐降低。利用在体子宫内胚胎电转实验,结果发现过表达或者敲低N-WASP均会造成不同程度的大脑皮层神经元迁移障碍,说明N-WASP在大脑皮层神经元迁移中起到关键作用。N-WASP蛋白主要包含4个结构域：WH1、GBD、polyPro和VCA。为进一步研究N-WASP各结构域在神经元迁移中的调控功能,设计了一系列的显性负性突变实验。通过过表达结构域删除的N-WASP蛋白,发现ΔpolyPro、ΔVCA和ΔWH1均能造成神经元迁移障碍。但是,过表达不能结合Cdc42的N-WASP蛋白(H208D突变体)却不能造成明显的神经元迁移障碍。另外,单独过表达N-WASP的结构域polyPro或VCA能够造成神经元迁移障碍,而过表达WH1结构域却不能影响迁移。最后,通过过表达polyPro和VCA结构域同时删除的N-WASP (WH1-GBD),发现WH1-GBD结构域对神经元迁移没有明显影响。上述结果表明N-WASP蛋白主要是通过polyPro和VCA两个结构域调控大脑皮层神经元的迁移过程。     

大脑皮层神经元放射状迁移的分子调控机制

神经元放射状迁移是一个复杂而又精确的过程,对大脑皮层的正常发育和功能发挥起着不可忽视的作用。近几年来的研究表明,许多重要的小分子分别从不同方面参与对这一过程的调控。对这些分子的调控机制进行深入研究,将有助于我们对神经系统发育机理和相关疾病发病机制的认识。下面就目前已发现的调控神经元放射状迁移的一些关键分子机制进行综述。     

长非编码RNA-Tug1在大脑皮层发育过程中的初步研究

哺乳动物大脑皮层发育过程中,神经前体细胞精密有序地产生不同类型的子代细胞,如神经元和胶质细胞.特异转录因子精确激活或抑制性状决定基因在该过程中发挥决定性作用.最近的研究发现,长非编码RNA(lncRNA)在器官发育和疾病发生过程中发挥重要的基因调控功能,但lncRNA在大脑皮层发育过程中发挥的作用尚不清楚.本研究发现,在小鼠大脑皮层发育过程中,lncRNA-Tug1的表达量随着神经元的产生而显著上调.组织原位杂交显示,在皮层发育的几个关键时期,Tug1广泛分布于背侧前脑神经前体细胞及其子代细胞中.应用小鼠子宫内电穿孔技术敲低Tug1,发现Tug1对神经前体细胞的增殖或分化没有显著性影响.本研究构建了特异针对Tug1转录起始位点上游的TALEN表达载体,在培养的小鼠细胞里发现它们具有显著的切割效率.下一步将在Tug1转录起始位点5′端敲入多聚腺苷酸尾(Poly A)信号片段,以构建Tug1失活小鼠模型,研究Tug1在皮层发育过程中的作用,并探索高效建立lncRNA失活小鼠模型的途径.     

小鼠大脑皮质脊髓投射神经元核糖体蛋白质相关基因表达的研究

该研究采用激光显微切割技术从小鼠大脑第五皮层捕获少量皮质脊髓投射神经元,并分析其分子生物学特征。首先,提取神经元微量RNA,再借助WT-ovation试剂盒扩增RNA,随后利用合成的cDNA进行荧光定量PCR实验,分析投射神经元核糖体蛋白相关基因的表达情况。结果发现,与大脑皮层其它皮层组织相比,第五皮层投射神经元内部分核糖体蛋白相关基因的表达相对较高。这表明第五皮层投射神经元可能具有活跃的蛋白质合成功能,是核糖体蛋白质的能量场所,借此维持第五皮层脊髓投射神经元长轴突和大胞体的能量需要。     

p85a基因对小鼠大脑皮层投射神经元迁移的影响

Pi3k/Akt信号通路是近年来发现的参与细胞增殖、调控的重要通路,Pi3k激活可介导多种细胞功能,Pi3k由p85a和p110构成。该研究通过干扰p85a基因的表达,探讨其在小鼠大脑皮层投射神经元迁移中的作用。首先,构建p85a基因的对照质粒（scramble）、siRNA质粒（sip85a-1、sip85a-2）和过表达质粒（OEp85a）;接着转染N2a细胞,48 h后,用定量PCR方法检测p85a基因mRNA的表达情况。随后,将sip85a-1、sip85a-2、OEp85a质粒分别转入小鼠大脑,4 d后,借助免疫荧光方法检测皮层神经元的迁移情况。定量PCR结果显示：与对照相比,转染sip85a-1、sip85a-2均能显著降低N2a细胞中p85a基因的mRNA表达,抑制效率约为40%（P〈0.05）;而转染OEp85a质粒后,能显著增加p85a基因mRNA的表达,约为对照组的12倍（P〈0.01）。胚胎电转结果中,各区EGFP阳性神经元数目定量分析显示,sip85a-1、sip85a-2、OEp85a质粒均能显著抑制神经元的迁移（P〈0.05）。大脑发育阶段中,p85a基因在适当范围内,对平衡神经元迁移过程中起着重要作用。     

金黄地鼠胼胝体纤维的电镜研究

哺乳动物的胼胝体是连接大脑两半球的纤维带,由皮层中的胼胝体神经元轴突构成,其末梢终止于其细胞体相对应的对侧皮层区。通常视觉胼胝体神经元和末梢集中于视皮层两相邻区交界附近。电生理工作表明,猫17/18、啮齿动物17/18a区交界附近的胼胝体投射带与动物的视野垂直中线有关,胼胝体在动物的双眼视觉中起重要作用。虽然对胼胝体结构的研究资料很多,但关于胼胝体纤维的超徽结构的报道较少。本篇报道对金黄地鼠胼胝体纤维的电镜研究,试图为探讨金黄地鼠胼胝体的功能提供形态学依据。     

Gsα调控小鼠大脑皮层发育

异源三聚体G蛋白激活alpha亚基(Gsα),是一种普遍存在的鸟苷酸结合蛋白,调节受体介导的胞内cAMP信号通路进而参与调控细胞的生命活动。目前Gsα信号通路的研究主要在生物化学和药物方面,但在小鼠大脑皮层发育中的作用还没有详尽的描述。本研究首先利用cre-loxP系统在小鼠大脑皮层神经前体细胞中成功敲除Gsα基因;其次,通过收集出生后不同天数的正常小鼠和敲除小鼠,统计分析后发现敲除鼠的脑重和体重减轻;最后,对小鼠大脑做切片后染色,发现在小鼠大脑皮层条件性敲除Gsα基因的成年鼠中表达thy1-EGFP(增强绿色荧光蛋白)的神经元的数量减少,皮层形成异常。由此推测,Gsα在小鼠大脑皮层发育中发挥重要作用。     

MLP参与心肌肥大发生过程与Calcineurin/NFAT信号通路有关

心肌肥大是心肌细胞面对多种病理刺激时的共同反应,以心肌细胞体积增大和胚胎期基因的重新表达为标志.心肌发育调控基因肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)的表达异常与心肌肥大有关.为研究MLP参与心肌肥大发生的分子机制,采用去氧肾上腺素（phenylephrine, PE）刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用RNAi技术敲减MLP的表达,分析MLP与肥大信号通路钙调神经磷酸酶（calcineurin）/活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells, NFAT）的关系.结果显示, 原代培养的心肌细胞经一定浓度的PE刺激后细胞表面积增加,肥大标志蛋白ANP、BNP表达增高,并伴有MLP表达上调. RNAi方法敲减MLP的表达则明显抑制PE诱导的心肌细胞表面积增加和BNP表达增高,并且直接 影响NFAT的转录激活活性,提示MLP与心肌肥大的发生密切相关,并且可能是通过calcineurin/NFAT信号通路而参与心肌肥大的发生.     

miR-34a敲除对小鼠大脑发育和行为的影响

miR-34a是一种进化保守并在脑中高表达的miRNA,已有研究显示其可能参与调控神经干细胞增殖和分化、神经元成熟和凋亡、恐惧记忆巩固等脑发育和功能的多个重要方面,但内源性miR-34a缺失是否显著影响脑正常发育和功能尚属未知。在本研究中,我们对miR-34a全敲除小鼠模型进行检测,发现miR-34a的缺失不影响成年鼠脑的重量、基本结构、大脑皮层的分层及其中几类主要类型的兴奋性和抑制性神经元的数量和分布,也不影响恐惧记忆的巩固及焦虑和抑郁样行为,但对小鼠的运动协调能力有一定影响。由于miR-34a在大脑皮层小清蛋白(parvalbumin,PV)亚型抑制性神经元中特异高表达,我们利用PV-Cre对miR-34a进行了条件敲除,但并未观察到这类神经元数量与分布的改变。我们的研究证明,miR-34a虽然参与调控小鼠大脑发育和行为的特定方面,但并非是调控大脑结构分区与皮层分层形成、皮层主要神经元类型产生与维持、恐惧记忆形成与巩固所必需的关键因子。     

C型利钠肽基因调控斑马鱼胚胎血管发育

本研究旨在探索C型利钠肽前体蛋白基因(natriuretic peptide precursor C,nppc)在斑马鱼胚胎期的表达及其在血管发育过程中的功能。利用胚胎整体原位杂交技术检测nppc基因在斑马鱼胚胎期的表达。同时使用转基因斑马鱼系Tg(flk1:GFP)和Tg(fli1a:n GFP),显微注射nppc特异性吗啉基反义寡核苷酸(morpholino)和nppc m RNA调控nppc基因表达,利用激光共聚焦显微镜观察分析斑马鱼节间血管(intersegment vessel,ISV)表型,并统计内皮细胞数目。结果显示,在受精后24 h和48 h,nppc基因在斑马鱼脑、心脏、血管系统中都有表达。下调nppc基因表达导致ISV发育缺陷,ISV内皮细胞数目减少。以上结果表明下调nppc基因表达可能通过抑制内皮细胞增殖和内皮细胞迁移调控斑马鱼胚胎血管发育。     

Sox11基因对发育期小鼠大脑皮层神经元迁移的影响

目的: 以小鼠为实验动物研究精神分裂症易感基因Sox11对皮层神经元迁移的影响。方法: 应用实时荧光定量PCR、原位杂交等技术明确发育期 (E14.5, P0, P7, P14) Sox11于大脑皮层的表达模式;应用质粒构建、转染、胚胎电转、免疫荧光染色等技术,对不同时期 (E17.5, P0, P4, P7) 的小鼠分别转染对照shRNA质粒、mSox11 shRNA质粒和mSox11 shRNA干扰恢复后质粒,研究Sox11在神经元放射性迁移中的作用。结果: 与对照组神经元相比,转染mSox11 shRNA的神经元迁移明显延迟。当对照组神经元有一部分已经到达新皮层的表层时,大部分转染mSox11 shRNA的神经元仍停留在新皮层中间区;使用大鼠Sox11基因 (rSox11) 过表达载体对小鼠Sox11基因的干扰进行恢复后,神经元迁移完成后的分布情况与对照基本一致。小鼠Sox11干扰后和干扰恢复后,室管膜下区 (SVZ)、中间区 (IZ) 和皮层板 (CP) 内迁移神经元分布具有显著性差异 (P＜0.01)。结论: Sox11可以促进皮层神经元的迁移,提示Sox11在小鼠皮层神经元迁移过程中发挥重要功能。     

microRNA-10a/b通过抑制Mib1调节斑马鱼神经元的发育

该文研究了microRNA-10(miR-10)家族miR-10a/b在斑马鱼胚胎发育时期神经管的表达及其对神经元发育的影响。通过斑马鱼胚胎整体原位杂交及Taq Man PCR技术分析研究miR-10a/b在斑马鱼胚胎期神经管的表达情况。利用吗啡啉(morpholino,Mo)修饰的反义寡核苷酸敲低技术建立miR-10a/b下调的斑马鱼模型,研究miR-10a/b下调后神经元发育异常的表型,并分析鉴定miR-10调控神经元发育的下游靶点。结果发现,受精后24 h(24 hours post fertilization,24 hpf)和48 hpf,miR-10a和miR-10b在斑马鱼神经管中高表达;miR-10a/b-Mo下调miR-10a/b的表达后,背神经管中神经元数量明显变少;下调Mib1(mindbomb E3 ubiquitin protein ligase 1)能挽救miR-10下调引起的神经元表型异常;miR-10a/b下调后胚胎神经管中Mib1表达显著上调。上述结果表明,miR-10a/b通过抑制Mib1的表达来影响斑马鱼神经元的发育。     

Mecp2在斑马鱼胚胎神经发育中对NOTCH信号通路的调控

旨在探讨Mecp2在斑马鱼胚胎神经发育过程中的调控及机制。利用Notch转基因鱼,通过原位杂交技术和激光共聚焦显微技术发现Mecp2在胚胎发育过程前期广泛表达,随后逐渐表达在脑部。在敲低Mecp2的胚胎中,Notch信号的表达明显降低,注射Mecp2-RNA和胞内NICD-RNA均能够恢复这种表型,标记神经成熟的神经因子Ngn1、Pax2、Pax3、Eno2、Map和RNA结合蛋白HUC表达下调。在敲低Mecp2后其靶分子转录抑制因子Hey2表达下调,敲低Mecp2阻碍了神经细胞的正常分化成熟,结果表明Mecp2能够通过Notch-Hey2信号通路来调控斑马鱼神经细胞的分化。     

时钟基因Bmal1促进血管平滑肌细胞增殖

摘要 目的：观察时钟基因Bmal1的过表达对血管平滑肌细胞增殖的影响,进一步探讨生物节律对于血管发育的具体影响。方法：采用包装GV341-Bmal1载体的慢病毒转染的方法构建大鼠胸主动脉平滑肌细胞（A7R5）稳定转染Bmal1的细胞系,实时定量PCR和细胞爬片Bmal1的免疫荧光染色的方法判断所构建细胞系是否稳定过表达Bmal1,细胞爬片Ki67的免疫荧光染色的方法观察时钟基因Bmal1的过表达对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果：实时定量PCR结果显示稳定转染Bmal1组细胞Bmal1的表达是对照组的11.2倍（P<0.01）;细胞爬片的免疫荧光染色结果显示稳定转染Bmal1组细胞BMAL1的表达明显升高（P<0.05）,且稳定转染Bmal1组Ki67阳性细胞比例明显升高（P<0.05）。结论：通过慢病毒转染的方法成功构建了血管平滑肌细胞稳定转染Bmal1的细胞系,细胞片Ki67的免疫荧光染色结果显示Bmal1的过表达促进了血管平滑肌细胞的增殖。     

神经元分化的信号转导

神经细胞的分化是神经系统发育过程中的重要事件之一 ,它涉及神经元的迁移、轴突的定向生长、突触发生和选择性凋亡等一系列过程。这些分化过程是在特定的信号分子精确调控下 ,由胞内信号通路介导完成的。1 .神经生长因子 (ＮＧＦ)诱导的Ｒａｓ Ｒａｆ ＭＡＰＫ原癌基因产物信号通路ＮＧＦ是第一个被发现的神经营养因子 ,它能诱导多种神经细胞的轴突快速生长 ,也能促使ＰＣ1 2细胞向交感样神经元的转变。ＮＧＦ的主要作用受体为ＴｒｋＡ ,为受体酪氨酸激酶家族成员。活化的ＴｒｋＡ通过接头分子Ｓｈｃ激活膜内表面的原癌基因产物Ｒａｓ ,活…     

Ghrelin在绵羊体内卵母细胞和早期胚胎的表达

为了明确ghrelin是否参与了卵母细胞成熟及胚胎早期发育进程,本研究利用免疫荧光技术和实时定量RT-PCR技术检测了绵羊卵母细胞和体内早期胚胎中ghrelin蛋白的表达定位和ghrelin mRNA水平相对表达变化规律。免疫荧光染色结果表明,ghrelin蛋白主要分布于卵母细胞胞质内;实时定量RT-PCR结果揭示绵羊卵母细胞和早期胚胎ghrelin mRNA的相对表达量依据发育阶段的不同而呈现一定变化规律,即在成熟卵母细胞,2细胞胚胎期和8细胞胚胎期显著高于未成熟卵母细胞和4细胞胚胎期(P<0.05),囊胚期表达量最高。卵母细胞和早期胚胎中ghrelin蛋白的表达及ghrelin mRNA特定的表达模式,揭示这一新型分子在绵羊卵母细胞成熟以及胚胎早期发育过程中具有潜在的调控作用。     

中脑多巴胺能神经元的轴突导向及其诱向因子

中脑多巴胺能神经元（mesodiencephalic dopamine,mdDA,neurons）由于涉及帕金森病、精神分裂症和药物成瘾等多种神经疾病的病理过程而历来受到人们的重视。研究中脑多巴胺能神经元的发育机制将给这些疾病的治疗带来希望。近来的研究表明多巴胺能神经元轴突的导向由各种诱向因子决定,诱向因子主要由相应投射部位的细胞所分泌,其中研究得最多的是ephrins,netrins,semaphorins,Slits及它们各自的受体。介绍胚胎期中脑多巴胺能神经元轴突导向过程及其主要诱向因子。     

神经元迁移的细胞和分子机制

在脑的发育过程中,神经元的正确迁移是正常脑组织发生的一个必不可少的环节。在过去的几十年中,通过不同的学科方法,对于神经元迁移的机制有了较好的理解。在细胞水平上,神经元迁移需要3个重复事件的精确调控;在分子水平,与神经元迁移相关的胞外信号分子已经被鉴定,而且大量的胞内信号通路也已经被阐明。     

综述与专论：生物钟Bmal1基因与慢性代谢性疾病及其运动干预研究进展

脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1基因（brain and muscle arnt-like 1,Bmal1）是生物钟的核心基因,在机体生命活动中发挥重要调控作用。生物钟的紊乱通常伴随Bmal1的异常表达,进而诱发一系列慢性代谢性疾病。运动可上调Bmal1表达,减缓慢性代谢性疾病的发病进程。本文主要对生物钟Bmal1在慢性代谢性疾病中的作用及其运动干预研究进展进行综述,提出Bmal1在运动改善慢性代谢性疾病中的可能作用机制,以期为运动通过生物钟基因防治慢性代谢性疾病提供新视角。