产毒和非产毒霍乱弧菌在甘露醇发酵液和Luria-Bertani培养液中的基因表达差异

[目的]分析霍乱弧菌产毒株和非产毒株在甘露醇发酵液和LB(Luria-Bertani)培养液中生长的基因表达谱和代谢差异特征.[方法]提取甘露醇发酵液和LB培养液中霍乱弧菌甘露醇慢发酵株(产毒株)N16961和快发酵株(非产毒株)93097生长第一小时的总RNA,应用霍乱弧菌N16961基因组芯片分析各菌株在不同培养液中的表达差异基因.[结果]筛选出产毒株N16961在甘露醇发酵液和LB中表达差异基因142个,非产毒株93097有418个,这些表达差异基因主要分属于6个不同的功能类群,主要是转运结合、能量代谢以及蛋白质合成代谢功能.[结论]甘露醇发酵液和LB中产毒株和非产毒株的许多功能基因的转录水平有显著差异,这些表达差异基因可能与霍乱弧菌在甘露醇发酵液中代谢产酸有关,这为进一步分析霍乱弧菌代谢甘露醇的机制、以及分析产毒株与非产毒株的甘露醇发酵快慢机制提供了基础.     

产毒和非产毒霍乱弧菌在甘露醇 和Luria-Bertani培养液中的基因表达差异

摘要：【目的】分析霍乱弧菌产毒株和非产毒株在甘露醇发酵液和LB (Luria-Bertani) 培养液中生长的基因表达谱和代谢差异特征。【方法】提取甘露醇发酵液和LB培养液中霍乱弧菌甘露醇慢发酵株（产毒株）N16961和快发酵株（非产毒株）93097生长第一小时的总RNA,应用霍乱弧菌N16961基因组芯片分析各菌株在不同培养液中的表达差异基因。【结果】 筛选出产毒株N16961在甘露醇发酵液和LB中表达差异基因142个,非产毒株93097有418个,这些表达差异基因主要分属于6个不同的功能类群,主要是转运结合、能量代谢以及蛋白质合成代谢功能。【结论】甘露醇发酵液和LB中产毒株和非产毒株的许多功能基因的转录水平有显著差异,这些表达差异基因可能与霍乱弧菌在甘露醇发酵液中代谢产酸有关,这为进一步分析霍乱弧菌代谢甘露醇的机制、以及分析产毒株与非产毒株的甘露醇发酵快慢机制提供了基础。     

4株霍乱弧菌非产毒株溶源性噬菌体pre-CTXΦ 的基因组结构分析

霍乱弧菌溶源性噬菌体CTXΦ携带霍乱毒素基因ctxAB,通过其结构基因gⅢ编码产生的PⅢ蛋白识别霍乱弧菌毒素共调菌毛(toxin co-regulated pilus, TCP)的主要结构亚单位TcpA,从而感染具有TCP的霍乱弧菌,使之成为产毒菌株。CTXΦ还有不携带ctxAB的前体pre-CTXΦ,根据CTXΦ基因组中调控基因rstR序列型不同,可分成不同的型别。在不同霍乱弧菌菌株的基因组中,已发现CTXΦ/pre-CTXΦ基因组及其亚型的多种组合排列方式。研究该噬菌体家族的基因组多样性,能够分析其进化及在霍乱弧菌产毒株形成中的作用。本研究发现了4株O1和O139群霍乱弧菌非产毒株具有pre-CTXΦ基因组及多样的rstR序列型,进一步对pre-CTXΦ在4株菌株中的基因组特征进行了分析。利用第3代基因测序法(短读长测序技术和单分子长读长测序技术),获得了4株菌株的基因组序列。利用长读长测序和拼接分析,精确地获得了具有长片段重复序列结构的pre-CTXΦ基因组排列,明确了4株测序菌株中多样的pre-CTXΦ基因组排列。在非产毒株基因组菌株VC3193中发现了携带古典型pre-CTXΦ;还在菌株VC702的pre-CTXΦ基因组中首次发现了肺炎克雷白菌的转座子结构(Gen Bank序列号：SRIL00000000)。在这4株测序菌株中,受体TcpA以及pre-CTXΦ的PⅢ蛋白也具有明显差异的序列,有 TcpA和PⅢ新序列型,这提示了CTXΦ家族感染宿主菌的受体-配体相互识别的复杂对应关系。本研究丰富了对CTXΦ/pre-CTXΦ家族基因组及其整合排列的多样化认识,也为分析该溶源性噬菌体在不同遗传特征霍乱弧菌菌株间的水平转移和促使新产毒克隆形成方面提供了更多的证据。     

产河豚毒素菌株的分离鉴定

从厦门同安海域的黄鳍东方豚(Fugu xanthopterus)卵巢组织中分离纯化出59株菌株,通过小鼠试验筛选出11株产毒菌株,并对其中产毒能力较强的EL10菌株的发酵产物进行高效液相色谱分析,初步认定发酵产物中含有河豚毒素。同时对EL10菌株进行16S rDNA鉴定,结果表明该菌属于希瓦氏菌属(Shewanella)。     

我国霍乱弧菌的脂肪酸分型研究

目的 对脂肪酸分型方法在霍乱弧菌菌株鉴定、菌株相似性分析等方面的应用价值进行评价。方法 选取了分离自我国的两个主要致病血清群的194株霍乱弧菌菌株（1961年以来的El Tor型和1992年以来的O139群）,提取脂肪酸,应用MIDI公司的脂肪酸分型系统,进行数据分析。结果 检测的所有菌株都含有的脂肪酸成分有13种。霍乱弧菌的判断符合率为88.6%。二维聚类分析没有成明显可区分的群, O139群霍乱弧菌的脂肪酸组成与O1群的相似,产毒与非产毒霍乱弧菌的脂肪酸成分没有显著差异。结论 脂肪酸分型对弧菌种的快速鉴定有应用价值,对霍乱弧菌的现场分离鉴定有辅助意义,在小样本暴发资料的研究中能够反映菌株之间的亲缘关系,但其对霍乱弧菌种属内的各种特征性菌群不具有鉴别能力。     

多重实时PCR检测产毒素性霍乱弧菌和副溶血弧菌

设计引物和探针,优化多重实时PCR条件,以同时检测霍乱弧菌霍乱毒素基因ctxA、副溶血弧菌种特异性基因gyrB和耐热肠毒素基因tdh。该多重实时PCR方法检测产毒素性的O1群(3株)和O139群(44株)霍乱弧菌菌株、不产毒素的O1群(12株)和O139群(6株)及非O1非O139群(7株)霍乱弧菌菌株的ctxA,阳性和阴性结果与普通PCR检测结果100%符合;检测副溶血弧菌种特异性gyrB,116株副溶血弧菌均阳性,而9株其它细菌和72株霍乱弧菌均阴性;检测tdh的阳性和阴性结果也与普通PCR结果完全一致。另外还建立了检测副溶血弧菌菌株trh1和trh2的单重实时PCR方法。     

霍乱毒素(CT)基因探针的构建及其对霍乱弧菌的检测

用体外DNA重组技术构建了CT基因重组质粒pMM-CTII。应用XbaI/EcoRl双酶解,琼质糖凝胶制备电泳回收含C2基因的片段,以DNA缺口转译技术用a-32P标记的CT基因探针与01群霍乱弧菌经典型及埃尔托生物型产毒株杂交为阳性,与01群霍乱弧菌非产毒株及非01群无毒株杂交为阴性。对从临床及外环境分离的埃尔托霍乱弧菌进行了检测,流行株52株,检出率为92％;抗性株50株,检出率16％。显示利用CT基因分析较噬菌体分类更确切可靠。     

PCR检测霍乱弧菌RTX吸毒素基因

建立了一种扩增最近发现的霍乱弧菌RTX毒素基因的PCR方法。在世界各地引起流行和散发霍乱病例的166株临床和环境霍乱弧菌分离物中,用PCR和Hep—2细胞细胞毒性试验发现它们都是产毒的。而在相关基因簇中有缺失的古典生物型标准株用这两种方法结果都是阴性。这是第一个用于鉴别O1群霍乱弧菌古典生物型菌株和E1　Tor生物型菌株以及包括O139血清型的其它非O1群菌株的快速基因分型方法。建立的PCR方法也可特异性地检测霍乱弧菌中的RTX毒素基因,因为用此RTX毒素特异性PCR以及Hep—2细胞毒性试验时副溶血弧菌、致腹泻性大肠杆菌、气单胞菌和邻单胞菌的临床分离株都是阴性。这些结果使霍乱弧菌中RTx毒素的特性明显了。其在细菌致病中的作用需要进一步研究。     

霍乱cT-B和LPs-o双价抗原工程菌苗株的构建

作者将霍乱弧菌O抗原及毒紊B亚单位基因片段,经DNA体外重组技术,得到了能表达双价抗原的工程菌株1046(pMG305)。经GMl一ELlsA分析表明该菌株能够表达特异的霍乱cT—B抗原,且能分泌到胞外,通过菌体凝集,全细胞O抗原酶联分析和血凝抑制试验表明在1046(pMG305)菌体表面表达了霍乱的0抗原,它的脂多糖O抗原通过sDS-PAGE电泳分析．显示它表达了霍乱LPs的特征区带。小鼠腹腔免疫后用霍乱弧菌毒株攻击表明．有良好的保护作用．因此1046(pMG30s)可望成为霍乱活疫苗的候选株。     

渤海红鳍东方豚体内产毒细菌的微生态分布及B3B菌株的生物学特性

对我国渤海红鳍东方豚(Fugu rubripes)体内产毒细菌的微生态分布进行了考察.结果表明,渤海红鳍东方豚体内的各部位都普遍存在着产毒细菌,从其卵巢、肝脏等组织中分离到了19株可产强毒的菌株,对其中B3B菌株进行进一步研究鉴定,生理生化试验及16SrDNA序列测定结果表明,该菌属于芽孢杆菌属(Bacillus).同时,对其发酵产物进行分离精制后,通过小鼠试验、薄层层析试验及质谱分析,初步认定发酵产物中含有河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX).     

霍乱弧菌和副溶血弧菌分离株的gyrB基因系统发育分析

依据gyrB基因部分编码序列构建系统发育树以分类和鉴别霍乱弧菌和副溶血弧菌,并探讨其种系发生关系。扩增并测序13株霍乱弧菌、8株副溶血弧菌、2株嗜水气单胞菌及1株类志贺邻单胞菌的gyrB基因(编码DNA促旋酶B亚单位)序列,并采用距离法与最大似然法构建系统发育树。两种方法所构建的树结构完全一致,霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌及类志贺邻单胞菌各自形成一个独立的簇。其中,霍乱肠毒素基因(ctxA)阳性的霍乱弧菌(8株O139群与2株O1群ElTor型)聚类成一分枝;3株副溶血弧菌临床株(1株2002年流行株,2株2004年分离株)与1日本菌株及2001年1株自环境分离的毒力株聚类。系统发育分析靶分子gyrB基因可以良好区分上述4种常见病原菌。产毒O139群霍乱弧菌与产毒O1群ElTor型霍乱弧菌关系密切。副溶血弧菌环境毒力株与本地区临床主要流行株在系统发育关系上较为接近,可能是潜在的致病菌。     

信息库

1　乳酸乳球菌基因工程菌产生甘露醇　　甘露醇对健康有利 ,发酵时增加食品中甘露醇的含量可以提高发酵食品的营养价值。甘露醇是一种低热量甜味剂 ,在小肠中吸收很慢 ,它还是氢氧根的清除剂。在人的肠道中 ,甘露醇可以转化成短链脂肪酸 (如丁酸 ) ,可以预防结肠癌发生。　　异型发酵乳酸菌在果糖发酵时通过甘露醇脱氢酶产生甘露醇。而在同型发酵乳酸菌中 ,只有失去NAD+ 再生能力的菌株才能形成甘露醇。本研究组曾报道 ,乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶缺失株可以合成甘露醇和甘露醇 1 磷酸。但是 ,在葡萄糖耗尽后甘露醇很快被吸收和代谢。本研究…     

猪链球菌2型不同mrp基因型与毒力的关系

【目的】猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是重要的人畜共患病病原,且有强弱毒株之分,但至今仍缺少合适的毒力标志基因来鉴定致病性SS2。本文旨在研究mrp基因型与SS2毒力的关系。【方法】通过PCR方法鉴定不同SS2菌株的mrp基因型。再通过"内标"化的斑马鱼感染模型和实时荧光定量PCR,分别测定不同mrp基因型菌株的毒力水平和mrp转录水平。【结果】根据PCR结果可将53株SS2分为mrp-A型(27株)和mrp-B型(26株)两种基因型;mrp-A型菌株比mrp-B菌株毒力偏强,且A型菌株中mrp转录水平更高。【结论】发现mrp基因在SS2中分布广泛,但不同菌株中mrp基因型不同,mrp-A型菌株的致病力更强。而且,以mrp非保守区域作为诊断靶点能有效鉴定SS2强毒株。     

应用噬菌体肽库筛选能封阻霍乱噬菌体VP1转染菌细胞的寡肽

噬菌体感染细菌首先要吸附于细菌表面受体 ,从目前报道的细菌与噬菌体相互作用的研究中发现 ,这些受体包括细菌细胞外膜上的蛋白、糖脂结构和鞭毛等。霍乱弧菌是霍乱的病原体 ,高守一等 (副霍乱资料汇编 ,1 984,2 37～ 2 4 5 .)从国内分离并选择出 5株噬菌体 (VP1～VP5 ) ,根据霍乱弧菌菌株对噬菌体的敏感性不同 ,将埃尔托型霍乱弧菌分为 32个噬菌体型。结合生物学分型方法 ,可区分埃尔托型霍乱弧菌的两类不同菌株 (流行株和非流行株 )和不同菌型。对各种来源的菌株进行分型 ,可作为一种追溯传染来源、传播途径和分析流行形式的流行病学研…     

鸡舍环境中tri5基因阳性镰孢菌的分离及其产毒特性

【目的】探讨利用tri5-PCR鉴定产毒镰孢菌的可行性以及tri5阳性菌株的产毒特性和产毒条件。评估鸡舍空气和固体基质中镰孢菌分离株中产单端孢霉烯族毒素潜力的发生率。【方法】利用编码单端孢霉烯族毒素合成酶的起始基因(tri5基因)对139株镰孢菌分离株进行PCR检测,并对tri5阳性菌株进行产毒培养,通过免疫亲和柱-高效液相色谱方法来检测培养产物中的T-2毒素和HT-2毒素含量。【结果】共筛选到42株tri5阳性菌株,其中分离自鸡舍空气中的10株tri5阳性菌株经产毒培养后7株菌株产生T-2毒素(1.36-5 ng/mL)或HT-2毒素(6.1-17.1 ng/mL)。在5℃-20℃间隔24 h变温、光照与黑暗间隔24 h交替、前期振荡后期静止的培养条件下培养9 d镰孢菌的产毒量最高;镰孢菌的产毒量与温度和时间显著相关,而与菌丝体干重无显著相关性。【结论】与传统鉴定产毒镰孢菌的方法比较,tri5-PCR更适用于快速、准确地检测大量鸡舍环境样本中的产毒镰孢菌。本研究为养殖环境的产毒镰孢菌的危害预警和控制提供技术支撑和理论依据。     

拆分网络分析22株蛹虫草亲缘关系及高产虫草素菌株初筛

对22株蛹虫草Cordyceps militaris的ITS序列进行分析,并基于拆分网络法splits networks,分析供试菌株的亲缘关系,再进一步比较供试菌株发酵产虫草素能力,筛选出高产虫草素菌株。结果表明,22株蛹虫草的ITS序列长度在518-539 bp之间,对位排列后有39个差异位点,其中有12个简约信息位点,并且都发生在ITS1区;构建的拆分网络显示22株虫草聚为3个类群,每个类群因其特有的碱基替换而区别于其他菌株;22株蛹虫草发酵产虫草素性能差异很大,且虫草素主要存在于胞外液中,MF27的胞外液虫草素含量为332.74 mg/L,显著高于其它菌株(P0.05)。本研究为研究蛹虫草菌株间的系统关系和种质资源管理提供了依据。     

临床分离金黄色葡萄球菌药物敏感性及其生物膜形成能力的研究CSCD

目的 初步探讨临床分离金黄色葡萄球菌药物敏感性与其生物膜形成的关系。方法 收集2020年1月至2022年1月大同市第二人民医院检验科临床送检的痰液、尿液、血液和伤口分泌物等样本。采用VITEK-2全自动微生物菌株鉴定系统分离出非重复致病性金黄色葡萄球菌60株;采用刚果红试验定性鉴定产膜菌株和非产膜菌株;采用VITEK-2全自动微生物药敏试验系统进行药敏分析;采用96微孔板试验半定量鉴定菌株产膜能力。结果 通过VITEK-2全自动微生物菌株鉴定系统检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)32例(53.3%),甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(MSSA)28例(46.7%)。生物膜阳性菌30株(50.0%),生物膜阴性菌30株(50.0%)。其中,MRSA菌株产膜率53.1%,MSSA菌株产膜率46.4%,二者差异无统计学意义(P>0.05)。96微孔板试验筛选出强产膜菌株7株(23.3%),弱产膜菌株23株(76.7%)。强产膜菌株中,MRSA菌株6株,占85.7%,耐药5种以上占71.4%;弱产膜菌株中,MRSA菌株11株,占47.8%,耐药5种以上占26.1%;30株生物膜阴性菌,耐药5种以上占26.7%。结论 本研究临床分离的金黄色葡萄球菌中,MRSA菌株产膜能力强于MSSA菌株,产膜菌株耐药种类高于非产膜菌株。     

霍乱cT-B和LPs-o双价抗原工程菌苗株的构建

作者将霍乱弧菌O抗原及毒素B亚单位基因片段,经DNA体外重组技术,得到了能表达双价抗原的工程菌株1046(pMG305)。经GM1-ELISA分析表明该菌株能够表达特异的霍乱CT-B抗原,且能分泌到胞外,通过菌体凝集,全细胞O抗原酶联分析和血凝抑制试验表明在1046(pMG305)菌体表面表达了霍乱的O抗原,它的脂多糖O抗原通过SDS-PAGE电泳分析,显示它表达了霍乱LPS的特征区带。小鼠腹腔免疫后用霍乱弧菌毒株攻击表明,有良好的保护作用,因此1046(pMG305)可望成为霍乱活疫苗的候选株。     

抑制差减杂交克隆E1 Tor霍乱弧菌流行株与非流行株基因组差异片段及其分析

为了克隆与分析霍乱弧菌O1E1Tor流行株与非流行株两类菌株基因组差异片段 ,采用抑制差减杂交技术 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)分别以国内保留的流行株Wujiang 2及非流行株Js 32一株作为被检菌 ,另一株作为参考菌进行基因组差异研究 .在进行的差减杂交实验中 ,流行株Wujiang 2共检出 34个特异差异片段 ,经同源检索共代表 35个基因片段 ,其中包括许多重要的霍乱弧菌毒力相关基因如CTX遗传单元、TLC因子及可移动外来成分如霍乱弧菌整合子RVC序列及Tn10转位酶 .非流行株Js 32共检出 14个特异差异片段 ,经同源检索未能检出同源片段 ,可能代表新基因序列 .研究表明 ,霍乱弧菌流行株与非流行株基因组存在较多差异基因 ,表现在毒力、毒力相关基因、代谢以及其它噬菌体等可转移的基因成分     

非01群霍乱弧菌溶血素基因的初步研究

本文报导86个不同血清型非01群霍乱弧菌菌株,用含El Tor霍乱弧菌溶血素基因的同位素探针作菌落原位杂交,结果显示其中80个菌株(占93%)具有与El Tor霍乱弧菌溶血素同源性基因;其余6株菌则显示阴性结果,表明不存在这种溶血素基因。但用表型方法测定时,它们都显示有溶血性。此说明非01群霍乱弧菌中存在有不同种溶血素。