南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因的克隆及序列分析

目的:紫杉烷13α-羟化酶是紫杉醇下游合成途径关键酶之一,负责催化紫杉二烯-5α-醇的C13侧链发生羟基化反应生成紫杉二烯-5α、13α-二醇.该研究从南方红豆杉中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因并对其序列进行生物信息学分析.方法:利用南方红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因的DNA序列和cDNA序列,利用swiss-prot、DNAMAN等生物信息学工具对其核酸序列和蛋白序列进行分析.结果:测序结果显示其cDNA序列长度为1 651bp,含有一个1 458bp的开放阅读框,同源性比较分析结果表明,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的紫杉烷13α-羟化酶氨基酸序列的一致性为96%.结论:成功克隆出南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因,为利用合成生物学工程技术生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础.     

外显子拼接法克隆紫杉烷2α-羟基化酶基因与生物信息学分析

紫杉烷2α-羟基化酶是形成紫杉醇核心骨架的羟基化反应关键酶之一,以taxusin作为底物进行氧化生成2α,7β-dihydroxytaxusin.利用蔓地亚红豆杉的总DNA为模板,采用PCR技术克隆出紫杉烷2α-羟基化酶的DNA序列,利用在线比对和生物学软件分析其内含子,采用外显子拼接法克隆出紫杉烷2α-羟基化酶基因的cDNA序列.测序结果表明该基因含有1个1 488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸的多肽;同源性比较分析结果表明,其碱基序列及氨基酸序列与已经报道的加拿大红豆杉的紫杉烷2α-羟基化酶基因的一致性为分别为98%和89%.利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其列进行了序列分析,为利用代谢工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础.     

水杨酸对细胞培养生产紫杉烷的影响

研究了水杨酸对中国红豆杉细胞培养生产紫杉烷的影响。结果表明 ,适宜浓度的水杨酸对不同的紫杉烷的合成均有明显的促进作用     

利用RNAi抑制曼地亚红豆杉细胞紫杉烷14β-羟基化酶基因的表达

目的：利用RNA干扰技术抑制紫杉烷14β-羟基化酶(简称14OH)基因的表达。方法：以曼地亚红豆杉(Taxus×media)为材料,通过农杆菌介导的双元载体转化系统将针对14OH基因构建的RNA干扰载体导入该植物细胞中。应用PCR-Southern技术对转基因细胞进行了鉴定。另外,利用RT-PCR技术检测14OH基因mRNA表达水平,并采用HPLC技术对转基因细胞系中三种C-14氧取代的紫杉烷成分进行测定。结果：Southern检测证实转基因实验获得成功,RT-PCR结果表明转基因细胞系中14OH基因mRNA表达水平与对照组相比显著下降,HPLC分析显示C-14氧取代的紫杉烷含量也有明显降低。结论：该RNA干扰技术有效地抑制了曼地亚红豆杉细胞内14OH基因的表达,有望为提高紫杉醇的生物合成产量提供一条新途径。     

云南红豆杉中紫杉烷类二萜成分化合物的遗传毒性研究

目的:研究云南红豆杉中四种紫杉烷类二萜成分化合物(2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸)的安全性。方法:采用Alarmblue检测采用四种紫杉烷类二萜成分化合物在CHL细胞上的细胞毒性,采用CHL细胞染色体畸变实验和Ames试验,观察云南红豆杉中四种紫杉烷类二萜成分化合物遗传毒性作用。结果:四种紫杉烷类二萜成分化合物在CHL细胞株上IC500.5 mg/m L;未对鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸缺陷型菌株回复突变数产生影响;未使得CHL染色体畸变率增加。结论:在本实验条件下,未观察到2-去乙酰氧基紫杉宁E、7-去乙酰氧基紫杉宁J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉宁、巴宁亭酸对CHL细胞有明显的细胞毒性以及未观察到体外遗传毒性。     

红豆杉低温半致死温度和低温胁迫下紫杉烷含量

通过测定低温胁迫下红豆杉电阻抗参数和紫杉烷含量变化,确定适合红豆杉低温半致死温度测定的电阻抗参数,探讨低温对红豆杉紫杉烷生物合成的影响,为扩大红豆杉引种范围及利用低温条件提高红豆杉中紫杉醇含量奠定了理论基础。以云南红豆杉、南方红豆杉(山西长治)、中国红豆杉、曼地亚红豆杉和东北红豆杉为材料,分别采用电导率法和电阻抗法测定上述树种低温半致死温度,并利用LC-MS法测定低温胁迫下红豆杉叶片中紫杉烷含量和脱落酸(abscisic acid, ABA)含量。结果表明,5种红豆杉中,中国红豆杉、南方红豆杉(山西长治)、东北红豆杉和曼地亚红豆杉均能耐受-14.668--9.106℃低温;云南红豆杉能耐受-8.802--3.521℃低温,高于其他4种红豆杉。电阻抗τ_m参数与电导法测定的5种红豆杉一年生枝低温半致死温度显著相关,相关系数为0.912。低温胁迫下,红豆杉一年生叶片中紫杉醇含量高于当年生叶片。随着处理温度的下降,云南红豆杉和东北红豆杉一年生叶片中紫杉醇含量显著增加,中国红豆杉当年生叶片中巴卡亭Ⅲ含量和10-去乙酰基紫杉醇含量显著增加。此外,红豆杉叶片中ABA含量随温度的...     

紫杉烷13α-羟基化酶基因的克隆及其转化烟草的研究

本研究利用东北红豆杉(Taxus cuspidata )cDNA文库作为模版,通过PCR技术扩增得到我国东北红豆杉紫杉烷13α-羟基化酶(Taxane 13α-hydroxylase,简称13OH)的全长cDNA,将PCR产物克隆到pGM-T载体后测序结果表明该序列长度为1458bp。同源性比较分析结果表明：其碱基序列与已经报道的东北红豆杉(Taxus cuspidata)的13OH基因的一致性为99.38%,其氨基酸序列同与已经报道的东北红豆杉的13OH氨基酸序列的一致性为99.18%。将获得的cDNA全长序列正向插入到含有GUS报告基因的pCambia1305.1后成功地构建出东北红豆杉13OH植物表达载体pC13OH,通过电击法把pC13OH转入根癌农杆菌GV3101中。利用该工程菌株对普通烟草进行了转化,在潮霉素选择压力下获得了完整的再生植株。利用13OH基因特异引物,通过PCR技术筛选到4株阳性再生植株。在这4株再生植株中,有3株植株GUS报告基因的组织化学染色呈现阳性反应,表明该植物载体表达载体中与13OH相融合的GUS基因成功地得到了表达。本研究为今后深入研究13OH基因在烟草中的表达和开展紫杉烷13α-羟基化酶基因对红豆杉细胞的转化以及研究作用于该基因的小RNA调节子打下了基础。     

中国红豆杉愈伤组织紫杉烯合成酶cDNA片段的分离(简报)

从红豆杉的组织培养物中,筛选得到紫杉烷类化合物的高产株系,构建该株系的cDNA库,利用紫杉烯合成酶的特异性PCR引物对构建的cD－NA库进行PCR扩增,将得到的片段克隆后测序,该82bp片段与太平洋红豆杉紫杉烯合成酶相同片段完全一致。     

从南方红豆杉中筛选和鉴定25株产紫杉烷的内生真菌

为从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)中分离产紫杉烷的内生真菌,从其幼茎、树皮和叶片中分离纯化了491株内生真菌,经筛选获得25株内生真菌具有产紫杉烷的能力,其中,4株可产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,8株能产紫杉醇和巴卡亭Ⅲ,1株能产紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,1株能产巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,6株仅产紫杉醇,5株仅产巴卡亭Ⅲ。根据内生真菌的来源,幼茎中有11株产紫杉烷的内生真菌,叶片中有9株,而树皮中仅有5株。这些菌株的紫杉醇、巴卡亭和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ产量分别为0.64~9.87、0.48~3.42和0.20~1.00μg L~(–1)。因此,南方红豆杉中具有紫杉烷类代谢途径的内生真菌来源广,数量多,是研究真菌中紫杉烷类化合物代谢途径的良好材料,也为紫杉烷类抗癌药生产提供了潜在的真菌种源。     

南方红豆杉紫杉烷高含量植株系RAPD初步研究

南方红豆杉（Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ． ｍａｉｒｅｉ（Ｌｅｍｅｅ ｅｔＬｅｖｌ．） Ｃｈｅｎｇ ｅｔＬ．Ｋ．Ｆｕ） 是我国提取抗癌药紫杉醇的原料植物之一,但分布于不同地区的南方红豆杉其紫杉醇含量差异很大。应用ＲＡＰＤ技术,用２１ 个引物共扩增２５６ 条条带,其中有２２４ 条有多态性（８７．８ ％） 。结合紫杉烷及紫杉醇含量测定和植物形态分类,初步探讨了紫杉烷高含量植株的分子特征、形态和生境的相互关系。在供试的１２ 个地区２４ 个样品中,提出３ 个地区存在紫杉烷高含量植株系的可能性,为资源利用和保护以及优良品种的培育提供基