极端嗜热菌Thermus thermophilus HB8中天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为获得具有热稳定性的天冬氨酸转氨酶,从极端嗜热细菌Thermus thermophilus HB8中克隆得到天冬氨酸转氨酶基因aspC,并在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行表达,发现在Rosetta(DE3)中具有较高的表达量。重组酶的最适反应pH是7.0,37 ℃下在pH8～10的缓冲液中保温1 h酶活几乎不改变。重组酶反应的最适温度为75 ℃,酶活稳定的温度范围为25～55℃。重组酶在65℃时半衰期为3.5h,75℃时为2.5h。重组酶的K_m^KG为7.559mmol/L,V_max^KG为0.086mmol/(L·min),K_m^Asp为2.031mmol/L,V_max^Asp为0.024mmol/(L·min)。Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺等金属离子对酶活性有微弱抑制作用。     

Gluconobacter oxydans NH-10中短链D-阿拉伯糖醇脱氢酶的研究

以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)NH-10基因组DNA为模板,扩增得到D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因arDH,将其克隆到大肠杆菌表达载体JM109(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析ArDH的分子量约为30 kDa,是一个短链脱氢酶,既能催化D-阿拉伯糖醇氧化为D-木酮糖,又能催化D-木酮糖还原为D-阿拉伯糖醇。催化氧化反应时,对D-阿拉伯糖醇的K_m为60.67 mmol/L,V_max为0.803 U/mg;它能同时依赖于NAD⁺和NADP⁺,但是更加偏好辅酶NAD⁺;最适pH为12.0。还原反应对D-木酮糖的 K_m为36.39 mmol/L,V_max为1.71 U/mg;最优pH为7.0,最适温度均为30℃。     

蜜环菌胞外漆酶的合成、纯化及性质研究

研究了蜜环菌胞外漆酶合成条件和酶学性质。实验表明,培养基初始pH5.5、培养温度25℃有利于菌株产酶;与麦芽糖、山梨糖和半乳糖相比,纤维二糖和棉子糖作为碳源时漆酶产量更高;有机氮源比无机氮源有利于漆酶合成。泥炭提取液可显著诱导漆酶生成,当其含量为50%时,菌株漆酶最高产量是对照组的7倍。在蜜环菌发酵上清液中检测到3个漆酶同功酶组分,其主要活性（约占75%）组份漆酶A经 (NH₄)₂SO₄沉淀、制备级PAGE电泳和阴离子交换柱层析被分离纯化至电泳均一,SDSPAGE法测得酶亚基分子量59kD,凝胶过滤色谱法测定活性酶分子量58kD。纯化的漆酶A等电点pI为4.0,氧化愈创木酚的最适反应pH为5.6,最适温度为60℃,在60℃和65℃时半衰期分别为45min和36.8min,在pH5.2～7.2范围内稳定性较好。100mmol/L Cl^-对该酶有显著抑制作用,1mmol/L SO^2-₄ 对漆酶有激活作用,1mmol/L NaN₃可完全抑制酶活性,10 mmol/L EDTA对漆酶活没有明显影响,1mmol/L Cu²⁺对漆酶有激活作用。以愈创木酚为底物时,测得酶的K_m=1.026mmol/L,V_max=5μmol/(min·mg);以ABTS为底物时,测得其K_m=0.22mmol/L,V_max=69μmol/(min·mg)。     

一株海洋来源铜绿假单胞菌Gxun-7角蛋白酶基因的克隆、表达及重组酶酶学性质

【背景】角蛋白酶是一类特异性降解角蛋白的水解酶,在动物饲料、生物肥料、医学、洗涤、制革及环境治理等方面具有重要的应用潜力。【目的】对前期从海洋环境筛选出的一株铜绿假单胞菌Gxun-7的角蛋白酶基因进行克隆、表达,并探究重组酶酶学性质,为角蛋白酶在工业生产中的应用奠定基础。【方法】以铜绿假单胞菌Gxun-7基因组推定的角蛋白酶基因为基础,设计引物克隆获得角蛋白酶基因kp2,构建重组表达质粒pET22b-kp2,并转化到E. coliRosettagamiB (DE3)中进行诱导表达,同时对重组表达菌株的表达条件进行优化。利用镍柱分离纯化重组角蛋白酶并研究其酶学性质。【结果】重组角蛋白酶的分子量约为33 kDa,最适温度和pH值分别为40 ℃和8.0,在温度30-60 ℃和pH 6.5-8.0具有较好的稳定性。金属离子Co²⁺、Cu²⁺和化学试剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate,SDS)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)对酶活力有抑制作用,而Mg²⁺、K⁺、巯基乙醇和二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)对酶活力有促进作用。重组角蛋白酶具有良好的耐盐性,在12.5%的NaCl作用下相对酶活为87.55%。以酪蛋白为底物时,酶的K_m值为60.92 mg/mL、V_max值为9.70 U/mL。【结论】海洋来源铜绿假单胞菌Gxun-7的重组角蛋白酶具有良好的温度、碱、盐稳定性,可应用于工业生产中。     

绿色木霉MJ1产内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用KTAUPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后酶的比活力提高了28.6倍,回收率为19.7%。SDS-PAGE后经BIO-RAD凝胶成像系统分析该内切酶的分子量为64.7kD。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度53℃,最适pH为4.2,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,K_m和V_max分别为1.230×10^{-2相似文献}   

马肝醇脱氢酶催化有机硅酮不对称还原反应动力学

探讨了马肝醇脱氢酶(HLADH)催化三甲基硅乙酮及其碳结构类似物不对称还原反应动力学.结果表明,在酶浓度低于150 mg/L时,底物浓度与反应初速度的关系符合米氏动力学方程;HLADH催化三甲基硅乙酮不对称还原反应的K_m、v_max和E_a分别为2.67 mmol/L、0.118 mmol/(L·min·mg)和37 kJ/mol, 其碳结构类似物的相应值分别为3.56 mmol/L、0.084 mmol/(L·min·mg)和61 kJ/mol.     

Kinetics of urea uptake by Melosira italica (Ehr.) Kütz at different luminosity conditions

The kinetic parameters K_m and V_max for urea uptake by Melosira italica were determined at 160 μeinsteins m⁻² s⁻¹ and in the dark. The transport systems showed an affinity for the substrate and a storing capacity in the dark (K_m = 65.07 μM; V_max = 2.18 nmoles 10⁵ cells ⁻¹ h⁻¹) greater than under 160 μE m⁻² s ⁻¹ (K_m = 111.2 μM; V_max = 1.11 nmoles 105 cells⁻¹ h⁻¹). Similarly, a reduction in consumption rate of urea under increasing photon flux densities was observed. The use of an inhibitor (potassium cyanide) indicated that the uptake process requires metabolic energy. That urea transport is more important in darkness, may constitute a survival strategy in which this compound is utilized by cells mainly during heterotrophic growth.     

极端嗜热菌Thermus thermophilus HB8中天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为获得具有热稳定性的天冬氨酸转氨酶,从极端嗜热细菌Thermus thermophilus HB8中克隆得到天冬氨酸转氨酶基因aspC,并在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行表达,发现在Rosetta(DE3)中具有较高的表达量。重组酶的最适反应pH是7.0,37℃下在pH8～10的缓冲液中保温1h酶活几乎不改变。重组酶反应的最适温度为75℃,酶活稳定的温度范围为25～55℃。重组酶在65℃时半衰期为3.5h,75℃时为2.5h。重组酶的KmKG为7.559mmol/L,VmaxKG为0.086mmol/(L·min),KmAsp为2.031mmol/L,VmaxAsp为0·024mmol/(L·min)。Ca2 、Fe3 、Mn2 等金属离子对酶活性有微弱抑制作用。     

灵芝UDP-葡萄糖4-差向异构酶酶学性质研究及其应用

【背景】灵芝多糖是灵芝的重要活性物质之一。UDP-葡萄糖4-差向异构酶（UDP-glucose 4-epimerase,UGE,EC 5.1.3.2）是灵芝多糖合成途径中糖供体生成的重要酶,其参与了UDP-葡萄糖与UDP-半乳糖的相互转化,与多糖中半乳糖残基含量密切相关。【目的】通过对来源于灵芝的UGE基因进行异源表达,丰富灵芝多糖糖供体合成途径重要酶的酶学特性信息,深入了解灵芝多糖代谢合成途径。【方法】以灵芝菌株（Ganoderma lingzhi） CGMCC 5.26的cDNA为模板,克隆得到UGE基因GL30389,并在Escherichia coli BL21（DE3）中诱导表达,产物纯化后进行酶学性质、酶动力学、底物专一性及转化率的研究。【结果】灵芝UGE的分子量为45 kDa。最适反应pH值为6.0,在pH 7.0—9.0范围内有较好的稳定性;最适反应温度为30℃,温度在40℃时稳定性最好。Fe²⁺和Mg²⁺对UGE有激活作用。以UDP-葡萄糖为底物时,K_m为0.824 mmol/L,V_max为769.230 μmol/（L·min）,k_cat为1.333 s^—1,k_cat/K_m为1.618 L/（mmol·s）。灵芝UGE对D-葡萄糖、半乳糖醛酸及N-乙酰葡萄糖胺有催化活性。通过优化pH、温度、底物与酶的配比、添加金属离子将转化率从16.0%提升至39.4%。【结论】灵芝UGE与植物来源的UGE酶学性质较为相似,其催化效率优于大部分细菌来源的UGE。本研究丰富了灵芝多糖糖供体合成途径重要酶的酶学特性信息,有利于深入了解灵芝多糖代谢合成途径。     

嗜热古菌Infirmifilum uzonense来源的双功能高温β-葡萄糖苷酶IuBgl3的原核表达及酶学性质分析

β-葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究热点。本研究从嗜热古菌Infirmifilum uzonense中成功克隆出一个GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,命名为Iubgl3。基因序列分析显示Iubgl3全长为2109bp,编码702个氨基酸,理论分子量为77.0kDa。将该基因在大肠杆菌中进行克隆表达并对纯化后的IuBgl3进行酶学性质研究。结果显示,重组酶IuBgl3最适pH5.0,最适温度85℃。该酶具有良好的热稳定性,80℃处理2h后仍能保持85%以上的酶活力。其具有优良的pH稳定性,在pH4.0−11.0范围内处理1h,仍维持85%以上的酶活力。通过底物特异性测定发现,该酶对对硝基苯-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenylβ-d-glucoside,pNPG)和对硝基苯-β-d-吡喃木糖苷(p-nitrophenyl β-d-xylopyranoside,pNPX)均有很高的水解能力,是典型的双功能酶。以pNPG为底物时的动力学参数K_m和V_max分别为0.38mmol和248.55μmol/(mg·min),催化效率k_cat/K_m=6149.20s⁻¹mmol⁻¹。大多数金属离子对IuBgl3的酶活力没有显著影响,SDS可导致酶完全失活,而EDTA却能提高30%的酶活力。本研究丰富了高温古菌GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,获得了一个稳定性优良的高温酸性双功能酶,具有良好的工业应用前景。     

用单性结实基因2A11-iaaM转化罗汉果的研究

为了实现罗汉果生产中免除人工授粉和果实无籽化,该研究利用pBI121-Gus构建果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM的嵌合基因(2A11-iaaM)过量表达载体,以罗汉果雌株叶盘为材料,采用农杆菌介导法建立罗汉果高效遗传转化体系,转化和创制单性结实罗汉果种质,通过基因特异引物对的PCR扩增,初步检测出转基因阳性植株,将之移栽大田,观察转基因植株的单性结实性的表现。结果表明:构建罗汉果单性结实性相关的pBAI-Gus植物双元表达载体获得成功;建立了农杆菌介导的罗汉果叶盘遗传转化优化体系,即农杆菌菌液OD_(600)值为0.3～0.5,侵染10 min,最优选择培养基为MS+TDZ 0.7 mg·L~(-1)+IBA 0.5 mg·L~(-1)+Kan 5 mg·L~(-1)+Cef 300 mg·L~(-1);经PCR鉴定共获得4株转基因阳性雌株;将阳性植株扩繁后移栽田间,经田间调查发现,24株阳性扩繁植株中有5株正常开花,占总植株数的20.8%,且其子房未经人工授粉发育成幼果,表现单性结实性。在载体构建和农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系优化的基础上,将外源单性结实相关嵌合基因整合进罗汉果基因组并得到表达,为后续研究单性结实罗汉果的遗传生理,创制转基因罗汉果单性结实新种质,以及克服其产业化中需要人工授粉和无籽化提供了理论和应用基础。     

表皮葡萄球菌SarA对atlE、lipA和zinC基因表达调控的研究

表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermids) 是一种条件致病菌，SarA(Staphylococcal accessory regulator A)是该菌中一个全局性调控因子，它控制着细胞中许多与毒性相关的基因表达. 报道了SarA在转录水平直接调控atlE、lipA和zinC基因的表达. RT-PCR和lacZ报告基因的分析结果显示，在表皮葡萄球菌ATCC35984中，SarA对atlE (自溶酶基因) 表达起负调控作用，而对lipA (脂肪酶基因) 和zinC (膜相关锌金属蛋白酶基因) 的表达则有正调控作用. 生物信息学分析表明，SarA控制atlE，lipA和zinC 3种基因表达可能是通过与被调控基因上游的特定DNA序列的结合来实现的，该DNA结合区保守并富含AT碱基. 根据已报道的金黄色葡萄球菌中SarA的结合位点序列，利用Omiga软件分析并推测了SarA结合atlE，lipA和zinC的可能区域. 基于SarA是一种多功能的毒素相关调控因子，结果提示，SarA能调控众多因子，可以作为防治表皮葡萄球菌感染的一个药物筛选靶点.     

藏药多刺绿绒蒿种子萌发特性研究

多刺绿绒蒿(Meconopsis horridula)为罂粟科绿绒蒿属一年生草本植物,是一种极具观赏价值和药用价值的高山植物,目前处于濒危状态,因此研究多刺绿绒蒿种子的萌发特性对其种子育苗及人工栽培具有重要意义。为了提高多刺绿绒蒿的种子发芽率,该研究以多刺绿绒蒿的种子为材料,分析了不同消毒剂、浸种时间、温度和外源植物激素对种子萌发特性的影响。结果表明:(1)最适消毒方法为75%乙醇1 min+3%H2O25 min,最适浸种时间为24 h,最适温度和光照条件为20℃/10℃(光照12 h/黑暗12 h),用无菌水浸种后的种子发芽率为49.67%。(2) GA_3100～600 mg·L~(-1)和NAA 5～30 mg·L~(-1)可以提高种子的发芽率、发芽势和发芽指数,缩短发芽启动时间和发芽持续时间,对种子的萌发有促进作用。(3) 6-BA 5 mg·L~(-1)和10 mg·L~(-1)对种子的萌发有一定的促进作用,但不显著,6-BA浓度≥15 mg·L~(-1)则抑制种子的萌发。(4)用GA3500 mg·L~(-1)浸种后的种子发芽指标最好,发芽率、发芽势和发芽指数分别为69.67%、33.00%、4.51,种子的发芽起始时间和发芽持续时间分别为10.67 d、11.67 d。     

罗布麻CesA基因家族的生物信息学分析

植物体中纤维素是细胞壁形成的主要成分,不仅参与细胞形态的建成,调控细胞发育,还参与细胞内多种细胞信号转导途径,进而影响植物体的生长发育。纤维素合酶是植物体合成纤维素的主要酶类。为了探究CesA基因家族对罗布麻生长发育及纤维素合成的调控机理,该文通过生物信息学分析方法,从基因家族鉴定、结构分析、蛋白理化性质与多级结构预测、亚细胞定位、信号肽、进化关系和顺式作用元件等方面,对罗布麻CesA基因家族进行系统鉴定和分子特征分析。结果表明:基于全基因组测序,罗布麻CesA基因家族鉴定含有15个成员,分布在罗布麻11条染色体中的8条上,其编码蛋白的氨基酸数量为730～1 158,相对分子质量81 280.81～130 123.18 kDa,理论等电点6.18～8.83。除了AvCesA3、AvCesA5、AvCesA7、AvCesA10和AvCesA11蛋白为稳定蛋白,其余成员均为不稳定蛋白;除了AvCesA12蛋白为疏水性蛋白,其余成员均为亲水性蛋白。该家族成员包含3～14个外显子,8～15个保守基序。编码蛋白主要分布于质膜与高尔基体上,无信号肽,二级结构以无规则卷曲与α-螺旋为主要构成元件。AvCesA15蛋白的跨膜结构域和三级结构与其他成员存在显著不同。罗布麻CesA基因进化时主要受纯化选择作用。对上游1 500bp区域顺式作用元件分析,结果显示罗布麻CesA基因受到光、温度、水分、氧气等环境因子及生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯、水杨酸等植物激素调控。该研究为进一步探究罗布麻CesA基因家族的生物学功能、提高纤维品质与品种改良奠定理论基础。     

瑞香属和荛花属的数量分类研究

瑞香属和荛花属为瑞香科瑞香亚科的落叶或常绿灌木,中国西南部是瑞香属和荛花属的重要分化中心。全世界共有瑞香属95种、荛花属70种,中国分布有瑞香属52种、荛花属49种。瑞香属和荛花属的分类学研究一直存在不同程度的分歧。花盘形状和果实类型在传统分类中一直是区分瑞香属和荛花属的典型特征,而花盘形态和果实类型在2个属中存在交叉和过渡,部分植物分类学家根据这些特征将两个属进行过不同程度的归并。该研究采用数量分类法对瑞香属77种(变种)和荛花属62种(变种)植物,选取32个形态学性状进行聚类分析和主成分分析。结果表明:聚类分析和主成分分析均显示两属均未形成单系类群。在主成分分析中,前3个主成分分析的贡献值为35.56%,传统分类中用来区分两属的花盘形状、叶序及果实类型等特征对前3个主成分贡献相对较小,因此,传统分类学中对这两个属进行区分的性状并没有典型的分类学意义。同时,聚类图和主成分分析得到的散点图均不能将这两个属区分开来。数量分类研究结果显示两属植物存在明显的交叉,支持瑞香属和荛花属不是两个独立自然类群的观点。     

除虫菊TcALDH和TcGLIP基因启动子克隆及功能分析

天然除虫菊酯是从除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)中提取的绿色植物源生物杀虫剂。醛脱氢酶(TcALDH)和GDSL脂肪酶(TcGLIP)是除虫菊酯生物合成途径中的关键限速酶。为探究TcALDH和TcGLIP基因的功能,该研究从除虫菊无性系‘W99''中克隆得到TcALDH和TcGLIP基因的启动子,并通过生物信息学分析、组织化学染色(GUS染色)、荧光素酶报告实验和外源植物激素处理实验对其启动子的调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行分析。结果表明:(1)克隆得到的TcALDH和TcGLIP启动子序列分别为2 848、1 343 bp,均含有多个与逆境应答和激素信号相关的顺式作用元件。(2)分别构建了启动子和荧光素酶融合的植物表达载体,在烟草叶片中观察荧光成像发现,TcALDH启动子具有茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)激素诱导特异性。(3)用MeJA和ABA处理除虫菊‘W99''组培苗发现,TcALDH的表达量在12 h内受ABA诱导时上调,受MeJA诱导时先升高后降低,TcGLIP的表达量受ABA和MeJA诱导下调。(4)分别构建了TcALDH和TcGLIP启动子与GUS基因融合的植物表达载体,转化烟草并对其转基因叶片进行GUS活性染色发现,TcALDH启动子在烟草叶片腺体、腺毛头部及叶肉细胞中表达,而TcGLIP启动子仅在烟草叶肉细胞中表达。综上认为,TcALDH和TcGLIP的启动子具有组织特异性,TcALDH启动子具有MeJA和ABA激素诱导特性。该研究结果为除虫菊TcALDH和TcGLIP基因参与除虫菊酯合成的调控机制提供了新见解。     

麻疯树种子发育过程中JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达模式研究

油质蛋白基因对种子中油体的形成至关重要,该研究通过实时荧光定量PCR,对麻疯树的两个油质蛋白基因JcOle14.3和JcOle16.6在种子不同发育时期的表达模式进行了分析。结果表明:两个基因在种子发育初期(10~30 d)表达量逐渐升高,但表达水平均较低;40 d时表达量急剧增加并达到最高,而种子发育后期(50~55 d)两个基因表达水平均逐渐降低。由此可初步推测,JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达量可能与种子油脂积累量存在正相关。该研究结果为麻疯树油体形成机理和油质蛋白的深入研究提供了理论基础。     

柠条锦鸡儿F3H基因克隆及功能分析

柠条锦鸡儿为豆科灌木,对各种环境胁迫具有较强的适应能力,类黄酮是天然的抗氧化剂,花青素属类黄酮化合物,逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成,而黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因,命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框(ORF)为1095 bp,编码364个氨基酸,推测的蛋白质分子量为41.3 kDa,理论等电点为5.9。生物信息学分析发现,CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性,推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列,PlantCARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导,并且在低温胁迫下,CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述,研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。     

纤枝短月藓BeLEA2基因的克隆及表达分析

为探究纤枝短月藓LEA2基因的结构和表达特征,该研究以纤枝短月藓为材料,首次利用PCR克隆技术得到纤枝短月藓BeLEA2基因序列,并对该基因进行分析。结果表明:(1)该基因序列中含有2个外显子和1个内含子,其开放阅读框(ORF)为456 bp,编码151个氨基酸,预测其相对分子质量为16515.96 Da。(2)将纤枝短月藓与其他植物LEA2基因氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示纤枝短月藓与小立碗藓的亲缘关系最近。(3)利用HiTail-PCR技术克隆获得1072 bp的BeLEA2启动子序列,用PlantCARE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行预测,结果表明该启动子除了含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他顺式元件。(4)实时荧光定量PCR分析表明,BeLEA2基因在纤枝短月藓不同发育时期和不同组织中都有表达,且对脱水胁迫有响应。以上结果为进一步探究LEA2基因在苔藓植物中的功能及作用机制奠定了基础。     

马尾松细胞分裂素羟化酶基因PmCYP735A克隆与表达分析

该文首次在针叶树种马尾松(Pinus massoniana)中采用cDNA末端快速克隆(RACE)技术克隆,并鉴定出1个CYP735A基因。结果表明:马尾松CYP735A基因(PmCYP735A) cDNA全长为1 744 bp,包括1 647 bp的开放阅读框,44 bp的5'端非翻译区和53 bp的3'端非翻译区。该基因编码蛋白由548个氨基酸残基组成,其二级结构含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲。该基因编码蛋白不含跨膜区域,且无信号肽酶切位点,在399～406个和475～484个氨基酸残基存在P450超家族保守特征序列ETLRLYP(ExxRxxP)和血红素结合区域(Heme-binding region) FSFGPRKCVG (FxxGxRxCxG)。系统进化树分析表明,马尾松PmCYP735A与水稻、玉米、拟南芥CYP735A蛋白归属于同一小的进化枝,可可、毛果杨、麻风树和橡胶树等的CYP735A同源蛋白相对集中的定位于另一进化分支。实时定量PCR检测发现,PmCYP735A基因在马尾松根和茎中的表达量显著高于叶,该基因响应外源生长素NAA诱导表达,随着诱导时间呈现先上升再下降的表达趋势。以上结果有助于深入探究CYP735A基因家族的生物学功能及其在物种间的表达调控异同,为进一步挖掘马尾松优异基因资源奠定基础。