家蚕滞育卵与非滞育卵中几种关键酶活性的比较

家蚕Bombyx mori是卵滞育的昆虫, 在滞育期间无形态变化, 也不存在器官发育和组织分化, 然而其生理代谢过程仍在进行。为进一步研究家蚕滞育的机制, 本研究测定了家蚕滞育卵、 即时浸酸处理的滞育卵及非滞育卵在胚胎发育过程中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD, EC 1.15.1.1)、 过氧化氢酶(catalase, CAT, EC 1.11.1.6)、 丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK, EC 2.7.1.40)、 乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase, AchE, EC 3.1.1.7)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH, EC 1.1.1.28) 的活性变化。结果表明： 处理后1-7 d, 即时浸酸处理的滞育卵, SOD活性由56 517.00 U/g提高到81 986.94 U/g, CAT活性由14.98 U/g提高到106.90 U/g, PK活性由25.19 U/g提高到181.70 U/g, AChE活性由17.88 U/g提高到287.86 U/g, 而LDH活性由169.96 U/g下降到122.82 U/g。 而在非滞育卵中, SOD活性由86 417.99 U/g下降到66 024.19 U/g, LDH活性由169.07 U/g下降到135.02 U/g; CAT活性由1.47 U/g提高到44.37 U/g, PK活性由20.56 U/g提高到92.09 U/g, AChE活性由21.40 U/g提高到99.17 U/g。在滞育卵中, SOD和AChE活性较稳定; CAT活性随发育上升, 而LDH活性随发育而下降; PK活性在胚胎发育的前 4 d呈上升趋势, 随后基本保持稳定。通过了解家蚕滞育卵、 非滞育卵与即时浸酸卵的相关酶活性在胚胎发育过程中存在的变化, 有助于进一步揭示家蚕滞育的机理。     

葱蝇夏滞育蛹体内DaFOXO1对超氧化物歧化酶基因表达及蛹发育历期的调控作用(英文)

【目的】本研究旨在调查葱蝇Delia antiqua夏滞育蛹体内DaFOXO1对超氧化物歧化酶(SOD)基因表达及蛹发育历期的调控作用。【方法】从葱蝇转录组数据中鉴定DaFOXO1下游铜锌超氧化物歧化酶基因DaCu/Zn SOD和锰超氧化物歧化酶基因DaMn SOD;利用生物信息学工具对DaCu/Zn SOD和DaMn SOD的氨基酸序列特征、亚细胞定位和系统发育关系进行分析。通过qRT-PCR方法分析DaFOXO1, DaCu/Zn SOD和DaMn SOD基因在葱蝇夏滞育蛹不同发育阶段的表达特点;进一步分析DaFOXO1基因被干扰后,葱蝇夏滞育蛹中DaCu/Zn SOD和DaMn SOD基因的表达特点、酶活性变化及对葱蝇夏滞育蛹发育历期的影响。【结果】鉴定到的葱蝇DaCu/Zn SOD(GenBank登录号: KR072551)的开放阅读框长459 bp,编码153个氨基酸,预测蛋白分子量为22.4 kD,等电点为6.44,属于细胞质型铜锌超氧化歧化酶;DaMn SOD(GenBank登录号: KR072549)的开放阅读框长648 bp,编码216个氨基酸,预测蛋白分子量为24.4 kD,等电点为8.85,属于线粒体型锰超氧化物歧化酶。氨基酸序列比对结果显示,DaCu/Zn SOD和DaMn SOD与其他10种双翅目昆虫的同源蛋白有75%~94%的氨基酸序列一致性,且具有典型的SOD家族序列特征;系统发育分析显示它们与铜绿蝇Lucilia cuprina同源蛋白形成高支持率的一支。qRT-PCR分析表明,DaFOXO1基因在滞育前期和滞育后期的表达量较高,而在滞育期的表达量低; DaCu/Zn SOD基因在滞育期和滞育后期呈高表达;但DaMn SOD基因在滞育前期和滞育期的表达量最高,在滞育后期次之。干扰DaFOXO1可显著抑制DaCu/Zn SOD和DaMn SOD的基因表达及相应酶活性,并能明显延长夏滞育蛹的滞育期。【结论】结果说明,DaCu/Zn SOD和DaMn SOD是FOXO1信号网络中的重要成员;DaFOXO1对葱蝇夏滞育蛹蛹期有重要调控作用。     

即时浸酸显著提高滞育性家蚕卵辅酶Ⅰ和Ⅱ含量

即时浸酸在阻止家蚕Bombyx mori卵滞育发动的同时, 提高了其呼吸耗氧量, 抑制了山梨醇积累。本研究利用HPLC法测定了家蚕滞育卵和5 min即时浸酸滞育性卵中辅酶Ⅰ和Ⅱ含量。结果表明： 产下后24-72 h, 家蚕滞育卵中NAD, NADH, NADP和NADPH含量分别下降了30%, 37%, 50%和4%; 而即时浸酸滞育性卵中分别增加了77%, 46%, 142%和241%。不过, 即时浸酸并未显著改变滞育性家蚕卵中NADH/NAD和NADPH/NADP比值。据此推测, 即时浸酸提高滞育性家蚕卵辅酶Ⅰ含量与其呼吸耗氧量增加有关; 即时浸酸显著提高辅酶Ⅱ含量与山梨醇积累抑制无关, 而主要与生物合成加强有关。     

二化螟滞育生物钟蛋白TIME-EA4基因的克隆及时空和温度诱导表达分析

【目的】生物测时蛋白TIME-EA4是昆虫特有的一种滞育生物钟蛋白。本文旨在克隆二化螟Chilo suppressalis TIME-EA4基因,研究其在二化螟不同发育时期和不同组织中的时空表达模式及在不同田间种群和不同温度诱导下的滞育和非滞育种群中的表达水平。【方法】通过RACE技术克隆二化螟TIME-EA4基因全长c DNA序列,利用荧光定量PCR的方法检测TIME-EA4基因在二化螟不同发育时期、6龄幼虫不同组织中的表达模式,及在不同季节采集的田间种群和不同温度处理1h后的滞育和非滞育种群6龄幼虫中的表达量变化。【结果】从二化螟中克隆获得TIME-EA4的c DNA序列(Gen Bank登录号:KU356855),全长821 bp,开放阅读框516 bp,编码172个氨基酸;TIME-EA4基因在二化螟不同发育时期和不同组织中均有表达,且在早期蛹、雌雄成虫以及6龄幼虫的头部、脂肪体和中肠中表达水平较高,同时在滞育幼虫组织中的表达高于非滞育幼虫。此外,TIME-EA4基因在滞育种群中的表达量是非滞育种群的3倍左右,同时在非滞育种群中,该基因的表达明显受10℃及以下低温的诱导,且在10℃时表达量最高,而在滞育种群中该基因的表达受温度影响不明显。【结论】结果说明TIME-EA4基因与二化螟的抗低温胁迫以及低温滞育相关。本研究为TIME-EA4在农业害虫滞育的分子作用机制研究奠定了基础。     

家蚕中调控胚胎滞育的滞育激素及其受体研究概况

滞育是昆虫为躲避不良生存环境而进化出的一种个体发育停滞的生存策略和状态,家蚕Bombyx mori滞育发生于胚胎发育早期,为卵滞育型。家蚕胚胎滞育是由咽下神经节分泌的滞育激素作用于卵巢,通过卵巢细胞膜上的滞育激素受体介导,引发卵内一系列物质代谢变化而引发的发育事件。本文综述了家蚕滞育激素的发现及其结构与功能,以及滞育激素受体的基因克隆与表达、信号转导与机理等研究概况,并展望了其研究前景,以期推进家蚕胚胎滞育诱导、阻止和解除全过程的分子机理研究,并为进一步利用家蚕胚胎滞育进行传统养蚕业的技术提升等提供理论依据。     

家蚕BmAKR基因家族的鉴定及在蚕卵中的表达分析

醛酮还原酶超家族(aldo-keto reductase super family,AKRs)具有广泛的底物特异性,目前尚未见对昆虫AKR基因家族成员的系统鉴定报道。本研究采用生物信息学手段,预测了家蚕(Bombyx mori) AKR基因的系统进化、理化性质、染色体定位、保守基序和基因结构,通过转录组数据和实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析了不同组织时期及不同发育状态蚕卵中Bm AKR基因的表达水平,并采用Western blotting检测了蚕卵中该蛋白的表达量。本研究共鉴定出11个Bm AKR基因,分布在4条不同的染色体上,都具有AKR家族特有的(α/β) 8桶保守结构,理化特征较为相似;系统进化分析显示,其可分为2个家族(AKR1和AKR2)。转录组数据分析显示,家族成员基因在不同组织时期中的表达差异较大。进一步分析发现,一部分Bm AKR基因在非滞育卵的表达量显著高于滞育卵;但Bm AKR1-1在滞育卵中的表达量却显著高于非滞育卵。蛋白水平的检测发现Bm AKR1...     

家蚕胚胎发育中过氧化氢的代谢

过氧化氢（H2O2）是生物体内主要的活性氧来源之一。在超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等的催化作用下,H2O2被降解,释放出活性氧。所以,生物个体发育过程中体内H2O2、SOD和CAT含量的变化反映着H2O2的代谢水平。另外,家蚕是蚕卵滞育昆虫,实验设计考虑到了滞育前后可能会有的差别。取产后10分钟内的卵为供试材料。采用即时浸酸法解除卵滞育。采用比色法和氧电极法测定并比较家蚕胚胎滞育形成与解除过程中过氧化氢的代谢。结果表明：（1）受精初期最低水平（Fig.2);（2）胚胎发育过程中（即时浸酸除滞有）,H2O2量除168－216h处于低水平外均显著高于滞育卵（Fig.3),SOD活性分别在72h、168h,形成大小两峰,后期显著高于滞育卵（Fig.4),而CAT活性72－192h保持平衡,随后急剧上升,前期显著低于滞育卵,后于滞育卵（Fig.4),而CAT活性72－192h保持平衡,随后急剧上升,前期显著低于滞育卵,后期相反（Fig.5);(3)滞育形成过程中H2O2水平变化平缓（Fig.6),SOD活性前期剧烈活动,但后期保持平稳（Fig.7),CAT活性逐步升高（Fig.8),而浸酸解除滞育过程中H2O2水平显著高于滞育卵（Fig.6),SOD活性前期出现新峰,后期显著升高（Fig.7),CAT活性显著低于滞育卵（Fig.8)。结合他人的研究结果,可以推测：家蚕卵H2O2代谢状况可能在其滞育形成和解除中具有重要意义,或许酯酶A4计器假说与卵孔堵塞说可以通过H2O2而联系起来。     

不同催青方式对二化性家蚕过氧化氢酶基因表达的影响

25℃明催青和15℃暗催青分别诱导二化性家蚕Bombyx mori 产滞育性卵和非滞育性卵。此前我们的研究表明, 上述催青处理的二化性家蚕H₂O₂水平存在显著差异。过氧化氢酶（catalase, CAT）是昆虫清除H₂O₂的关键酶。为了进一步明确家蚕滞育过程中H₂O₂代谢的调控机制, 用RT-PCR测定了上述两种催青处理对二化性家蚕CAT基因表达的影响。结果表明：25℃明催青显著提高了滞育诱导和决定阶段的CAT mRNA 水平和CAT活性。滞育性卵的CAT mRNA水平在产后24 h形成峰值, 在72 h后消失; CAT活性在96 h前上升, 120 h后保持于低水平。非滞育性卵的CAT mRNA水平和CAT活性都随着胚胎发育而上升。可见, 25℃明催青诱导二化性家蚕子代滞育可能是通过影响CAT基因表达来调节H₂O₂水平。     

家蚕细胞周期蛋白基因BmCcnl1的克隆及表达分析

家蚕Bombyx mori由受精卵到完成胚胎发育孵化的过程中, 细胞进行大量的分裂和分化, 然而滞育性卵的胚胎细胞分化至G2期便停滞在此阶段。为了探索这一发育阶段细胞内的分子调控, 本研究以人Homo sapiens的细胞周期蛋白基因cyclin L1为模板, 成功克隆了家蚕同源基因BmCcnl1（GenBank登录号: FJ889988）。BmCcnl1基因开放阅读框（open reading frame, ORF）全长1 254 bp, 编码417个氨基酸。利用Protean软件分析得出BmCcnl1蛋白预测分子量为49 kDa, 等电点为9.84。利用DNA重组技术构建了BmCcnl1基因的重组表达载体pET-21d-BmCcnl1, 对其进行原核表达, 其表达的蛋白以包涵体形式存在。利用RT-PCR技术分析了BmCcnl1基因在胚胎发育过程中的转录水平, BmCcnl1基因在非滞育性卵的胚胎发育阶段基本保持相对稳定的转录表达, 而滞育性卵从蛾体产下经过72 h后已经检测不到BmCcnl1基因的转录。结果提示, BmCcnl1基因与胚胎期滞育及非滞育性卵的发育调控相关。对该基因的克隆和表达分析为今后研究家蚕胚胎发育及细胞周期调控奠定了基础。     

细菌AcrAB-TolC型外排泵中AcrA蛋白的进化分析

研究不同耐药细菌AcrAB-Tolc型外排泵中关键蛋白AcrA的序列,针对其保守及非保守氨基酸残基进行该类蛋白的进化分析,构建蛋白进化树。收集来源于不同细菌的已知序列的AcrA蛋白,去除冗余并进行序列比对之后,根据其序列比对结果的相似性、氨基酸残基的保守性研究其进化特征。结果表明,不同细菌的AcrA蛋白部分氨基酸残基具有高度的保守性,这与其实现生物学功能有关,非保守区域是主要的进化区域。可为不同菌株的进化提供参考,同时为以AcrAB-Tolc型外排泵为靶标的新药研究提供相关数据。