人源抗狂犬病毒中和性全抗体在昆虫细胞中的表达

将来源于噬菌体抗体库的人源狂犬病毒糖蛋白特异性单抗G10Fab的基因 ,克隆入杆状病毒人源IgG抗体表达载体 ,通过转染将重组质粒导入昆虫细胞 ,以全抗体的形式表达了一株人源抗狂犬病毒基因工程抗体G10。用亲和层析的方法纯化了表达产物 ,经与一株鼠源糖蛋白特异性单抗竞争证实 ,该单克隆抗体特异性识别狂犬病毒糖蛋白 ,亲和力约为 10 -9M。体外中和实验证明 ,该单抗对狂犬病毒aG株具有体外中和活性     

人源抗狂犬病毒中和性全抗体在昆明细胞中的表达

将来源于噬菌体抗体库的人源狂犬病毒糖蛋白特性异特单抗G10Fab基因的,克隆入杆状病毒人源IgG抗体表达载体,通过转染将重组质粒导入昆虫细胞,以全抗体的形式表达了一株人源抗狂犬病毒基因工程抗体R10。用亲和层析的方法纯化了表达产物,经过一株鼠源糖蛋白特异性单抗竞争证实,该单克隆抗体特异性识别狂犬病毒糖蛋白,亲和力约为10^-9M.体外中和实验证明,该单抗对狂犬病毒aG株具有体外中和活性。     

人源抗狂犬病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面呈现（phage display）技术获得了人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程单克隆抗体Fab段基因及其表达。从狂犬病毒PM株Vero细胞疫苗免疫的人抗凝血中分离获得外周淋巴细胞,提取细胞总RNA,通过RTPCR方法,用一组人IgG Fab基因4特异性引物,从合成的cDNA中扩增了一组轻链和重链Fab段基因,将轻链和重链Fab段基因,将轻链和重链先后克隆入噬菌体载体pComb3,成功地建立了抗狂犬病毒抗原的方法,对此抗体库进行富积筛选表达,成功地获得了抗狂犬病毒的人源单抗Fab段基因及其在大肠杆菌中的有效表达,对其中一株单抗G10进行了较为系统的分析,发现它与一株鼠源中和性狂犬病毒糖蛋白特异性单抗存在竞争,证实该单抗能识别狂犬病毒糖蛋白,其序列资料分析表明,该单抗为一株新的抗狂犬病毒人源基因工程抗体。     

重组痘苗狂犬病毒糖蛋白的构建、表达及其遗传稳定性研究

狂犬病毒糖蛋白基因的痘苗病毒表达质粒 pWS 4在鸡胚细胞内与野生型痘苗病毒天坛株 (痘苗病毒 )同源重组 ,经蚀斑纯化 ,获得表达狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒 (重组病毒 )。该重组病毒DNAdotblot显示强阳性信号 ,间接免疫荧光试验胞膜及胞浆均见到强阳性荧光反应 ,Westernblot分析仅在 6 4ku处呈现一条狂犬病毒非融合性糖蛋白带。免疫小鼠和狗 ,第 2 8d抗狂犬病毒中和抗体滴度分别达 2 4 30和 >6 96。初免后 14d用 5 0～ 10 0LD50 狂犬病毒CVS株对小鼠脑内攻击 ,保护率达 80 %以上。致病性明显减弱。从第 11代起连续传至 30代 ,病毒纯度、病毒滴度、血凝滴度、蛋白的表达、抗原活性和保护性均无差异 ,说明该重组病毒有良好的遗传稳定性。     

狂犬病毒糖蛋白的克隆表达及其在中和抗体检测中的应用

目的:制备基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原,并评价其在疫苗免疫后中和抗体检测中的应用价值。方法:TRIzol法从狂犬病疫苗中提取总RNA,经RT-PCR获得糖蛋白目的基因片段,构建相应的原核表达质粒,转化大肠杆菌HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,以重组蛋白作为包被抗原,初步建立检测糖蛋白中和抗体的ELISA方法。结果:获得狂犬病毒糖蛋白优势表位区段抗原,建立了糖蛋白中和抗体ELISA检测方法。该检测方法对59例健康献血员血浆样本检测特异性为98.31%(58/59),接种狂犬疫苗免疫个体血浆样本抗体阳性率为98.95%(94/95)。结论:基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原可用于人接种狂犬疫苗后疫苗免疫效果评价。     

人源抗狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位链置换基因工程抗体研究

为获得针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的人源单抗,本研究采用噬菌体展示平台,对一株狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号抗原表位的人源单抗CR4098采用链置换法进行改造。以CR4098单链抗体为骨架,从狂犬疫苗接种者外周血分离淋巴细胞,提核酸逆转录,PCR扩增抗体轻链可变区基因,替换CR4098的轻链基因,构建轻链置换文库。经纯化狂犬病毒aG株富集筛选,以上述筛选出的轻链阳性克隆为骨架,构建重链置换抗体库,富集筛选后通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定。利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能。结果显示,通过轻链置换,我们获得14株抗狂犬病毒scFv抗体,通过ELISA、IFA、亲和力测定及中和试验确定人源抗体RV3A5特异性结合狂犬病毒糖蛋白,对狂犬病毒CVS株和aG株均具有良好的中和活性,亲和力达到2.8×10-9 M。通过竞争ELISA对抗体结合表位进行鉴定,结果表明RV3A5特异性识别糖蛋白Ⅲ号抗原表位。通过链置换法成功获得1株全新的针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的高亲和力人源中和抗体,为狂犬病毒抗体制剂鸡尾酒治疗奠定了基础。     

SOE-PCR法合成狂犬病毒单链抗体基因Fv57

目的:通过一系列短引物拼接合成狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57.方法:采用SOE-PCR的方法,利用多条短的寡核苷酸引物,经过6轮PCR,拼接合成800bp左右的狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,并利用此方法修正了上述PCR过程中产生的多处突变,从而获得正确的单链抗体基因序列.结果:采用SOE-PCR法合成的基因序列经测序及酶切鉴定,与预期结果一致.结论:成功地利用SOE-PCR法合成了狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,为其下一步构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达奠定基础.     

重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体SO57、SOJB对狂犬病毒G蛋白亲和力的比较研究

一直以来,狂犬病是一种严重的人类致死性传染病。对狂犬病暴露后的预防主要是采用抗狂犬病毒免疫球蛋白（RIG）结合狂犬疫苗注射的方法。目前使用的两类RIG为人RIG（HRIG）和马RIG（ERIG）,它们都是从免疫血清中分离出来的。由于HRIG成本高且产量少,质量难以控制,有潜在病毒污染的风险;而ERIG存在引起过敏反应等问题,因此,人们期望抗狂犬病毒人单克隆抗体能够取代RIG,用于狂犬病的暴露后预防。在狂犬病毒的多种免疫原物质中,狂犬病毒糖蛋白（以下简称G蛋白）是诱导产生抗病毒免疫保护的一种主要抗原,同时也是诱导产生病毒中和抗体并与之反应的唯一抗原。针对G蛋白的抗狂犬病毒抗体中和细胞外的狂犬病毒,并介导感染细胞的裂解及抗体依赖性的细胞毒性。在Dietzschold等发现的几株针对G蛋白的人单克隆中和抗体中,中和毒株的范围最广、抗体效价最高的为SO57,除此之外,SOJB也是目前研究较多的针对G蛋白的人单克隆中和抗体。     

狂犬病毒核糖核酸蛋白(RNP)免疫猴子获得抗狂犬病的保护性免疫

<正>以前,人们认为狂犬病毒糖蛋白是能产生病毒中和抗体(VNA)和获得抗狂犬病保护性免疫的唯一抗原。新的研究表明,除了糖蛋白外,内部的核糖核酸蛋白(RNP)在诱导保护性免疫上也具有重要的作用。     

抗狂犬病毒单克隆抗体的研制

使用狂犬病毒CVS株鼠脑悬液灭活后超速离心提纯,加等量FIA腹腔免疫BALBC小鼠常规法融合,间接ELISA方法筛选,有限稀释法连续克隆6次,得一株能稳定分泌抗狂犬病毒单抗杂交瘤细胞株ID4,体外连续传代5个月,液氮冻存后复苏,仍能稳定分泌抗体。用常规法制备腹水,间接ELISA方法测定腹水效价为1：32乃孤儿用琼脂双扩散法测定杂交瘤上清浓缩物中鼠免疫球蛋白底op类。ID4腹水样品送检武汉生物制品研究所,用免疫荧光间接法鉴定设单抗为抗狂犬病毒糖蛋白。狂犬病毒糖蛋白可诱生中和抗体,也有细胞免疫功能和作用。我们制备的抗狂犬病…     

狂犬病毒感染与细胞凋亡

在狂犬病毒感染中,宿主细胞会发生凋亡性坏死.研究表明,在病毒感染过程中,狂犬病毒糖蛋白及基质蛋白均能诱导宿主细胞发生凋亡,有许多凋亡分子参与这个过程并起着作用.理解狂犬病毒感染与细胞凋亡的关系以及凋亡发生的可能机制,能为狂犬病的防治提供一些药物研究上的新思路.     

疱疹病毒α-亚科部份成员gC等同膜糖蛋白的同源性及进化

马疱疹病毒Ⅰ型属疱疹病毒α—亚科。本文分析了其膜糖蛋白g13基因的碱基序列,并由此推导其相应的氨基酸序列。同时利用电子计算机程序将g13与α—亚科的其它成员如伪狂犬病毒、水痘带状疱疹病毒和单纯疱疹病毒的相应膜糖蛋白进行比较,揭示了g13与伪狂犬病毒的g3、水痘带状疱疹病毒的gV和单纯疱疹病毒的gC同源,称为gC等同膜糖蛋白。这组膜糖蛋白都含有前导序列、跨膜疏水区域和天冬氨酸相关的糖基连结区。同时,这四种糖蛋白羟基端那一半的氨基酸序列高度保留,说明这一端具有重要的生物学功能;而氨基端那一半,除前导序列外,几乎找不出相似性。亚科中各病毒的寄主不同,各种糖蛋白在基因中的相应位置也不尽相同。同时,氨基酸序列的相似性较强,而碱基序列的相似性较弱。这一切表明,此亚科的病毒属同一起源而又经高度分化。     

南卡罗莱纳州阻止狂犬病野外试验

与Wistar研究所有联系的一个主要公共关系公司帮助它赢得在卡罗莱纳沿岸以外进行已计划好的野外试验的许可证. Wistar想在岛区部分浣熊群体上试验其狂犬病疫苗,这种疫苗是把狂犬病毒的糖蛋白插入到牛痘病毒弱化株中构成的. 这种试验地是很理想的.该岛区无人居住而只能乘船进入,而且该地区的浣熊从未受到狂犬病毒的侵染.在得到联合许可证之后,其它所需的一切只等南卡罗莱纳保健部的一     

狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化

旨在有效检测狂犬病毒抗原及抗体。以狂犬病病毒aG株为模板,反转录扩增糖蛋白膜外区基因,并进行序列测定。将目的片段与表达载体pET-32a(+)分别双酶切、胶回收后相连并转化至Rosseta(DE3)菌株。选取阳性克隆经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting及质谱鉴定。结果显示,在大肠杆菌中成功表达了糖蛋白膜外区。本研究为建立检测狂犬病毒抗原及抗体的ELISA诊断方法奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白嵌合狂犬病病毒HEP-GFP株的拯救

狂犬病毒(Rabies Virus,RV)是人和犬、猫等多种动物狂犬病的病原,其基因组是单股负链RNA,基因组结构为3'-核蛋白(N)基因-磷蛋白(P)基因-基质蛋白(M)基因-糖蛋白(G)基因-大蛋白(L)基因-5'.     

一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中;（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子;（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上,对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。     

狂犬病病毒保护性抗原与亚单位疫苗的研究进展

本文论述了狂犬病毒糖蛋白,尤其是核蛋白或核糖核蛋白（ＲＮＰ）作为狂犬病重要保护性抗原的特性。鉴于核蛋白诱生狂犬病细胞免疫的重要保护作用,以及脂质体中同时加入核蛋白及糖蛋白后,其保护水平与狂犬病全病毒疫苗相似,故以研制狂犬病双价亚单位疫苗为妥。杆状病毒载体优点多,其表达的狂犬病病毒核蛋白及糖蛋白可制备安全、有效疫苗的大规模使用,乃至口服使用。     

狂犬病毒抗体ELISA检测试剂盒的改进研究

为了提高狂犬病毒抗体检测的灵敏度和特异性,采用狂犬病毒单克隆抗体包被酶标板,再分别加入重组的狂犬病毒糖蛋白或细胞培养抗原做固相层的方法(抗体捕捉法),用传统的间接ELISA法做对照,按常规方法检测抗狂犬病毒抗体。结果显示,抗体捕捉法的非特异性反应低于间接法,而灵敏度达到0．51U水平,高于间接法。在800份临床标本检测中,检出率明显高于间接法。用15份阳性血清作小鼠中和试验,并和抗体捕捉ELISA法比较具有高度的一致性。试验结果充分表明,该方法优于传统的ELISA间接法。因此可作为临床注射狂犬疫苗后检测血清中狂犬病毒抗体的常规方法。     

人源中和性抗狂犬病毒基因工程抗体的研制

从具有高滴度狂犬病毒抗体的多位疫苗注射者采集外周血淋巴细胞,构建人源抗狂犬病毒Fab基因工程抗体文库。用纯化的狂犬aG和CTN株病毒颗粒富集筛选所得Fab噬菌体抗体文库,利用ELISA和间接免疫荧光法IFA鉴定所得人源单克隆抗体Fab段基因的功能特性,并通过序列测定确定所得抗体的轻链和重链的型别,成功获得11株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆Fab抗体。将其中5株人源单克隆Fab抗体的轻链和重链分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒系统实现全抗体的分泌型表达。5株全抗体在体外与狂犬病毒CVS-11株的中和反应中均显示具有狂犬病毒中和活性。人源中和性抗狂犬病毒基因工程全抗体的获得为我国自行生产抗狂犬病单克隆抗体鸡尾酒奠定了物质基础。     

狂犬病毒G蛋白和N蛋白在痘苗病毒天坛株中共同表达

本文构建了一个能同时表达狂犬病毒糖蛋白（Ｇ）和核蛋白（Ｎ）两种蛋白的重组组痘苗病毒。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和免疫荧光等方法证明Ｇ和Ｎ基因已重组到痘苗病毒ＴＫ基因区,而且能良好地表达。并证明该重组病毒在小鼠中具有良好的免疫效果。