固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶酶促合成头孢氨苄的研究

β—内酰胺系列抗菌素抗菌谱广、疗效高、毒副作用小,国际上研究与应用日渐广泛深入。头孢氨苄(Cephalexin)是重要的半合成抗菌素之一,由头孢霉素母核7—氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(简称7-ADCA)和侧链结构物苯甘氨酸或其甲酯(PGME)经酰化而生成。酰化有化学法和酶法两种。采用青霉素G酰化酶或a—氨基酸酯酶或,a—氨酰转移酶的酶法,具有工艺操作简单、无需基团保护、环境污染轻等优点。继日本人于70年代初试验成功酶法之后,80年代初我们开展了这方面研究。制备方面,胞外酶优于胞内酶;使用方面,固定化酶优于固定化细胞。在用具有青霉素G酰化酶活性的固定化大肠杆菌(Escherichia coli)细胞合成头孢氨苄的基础上,又研究了用固定化巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BP931胞外青霉素G酰化酶酰化合成头孢氨苄的条件。本文报道这一研究结果。     

固定化青霉素G酰化酶水解头孢菌素G制备7—ADCA的研究

用聚丙烯腈纤维固定化青霉素酰化酶水解头孢菌素G制备7-ADCA,固定化酶对头孢菌素G的最适pH为9.0,最适温度50℃。在37℃、pH8.0固定化酶对头孢菌素G的表观米氏常数为1.67×10~(-2)mol/L。最大反应速度为3.01mmol·g~(-1)·min~(-1)。头孢菌素G溶液浓度在2％以上时,对固定化酶有明显的抑制作用。固定化酶水解头孢菌素G的最佳投料浓度为5％～6％,水解时用酶量以每克头孢菌素G投300U以上为好。按上述条件水解头孢菌素G,操作25批后固定化酶保留活力77.8％,7-ADCA平均收率92.68％。     

固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键连接到醋酸纤维素载体上,制成的固定化青霉素酰化酶的表观活力达2000 u／g左右(PDAB法)。水解lO％(w／v)的青霉素G钾盐落液,使用30批,保留活力70％以上。6-氨基青毒烷酸(6-APA)总收率平均达88．37％。固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的最适pH为9．95,最适温度为55℃,表观米氏常数为1.093×10-2mol／L,在pH 5．8-10．7,温度45℃以下酶的活力稳定。     

聚丙烯腈纤维固定化青霉素酰化酶合成头孢氨苄的研究

将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚丙烯腈纤维的衍生物上。制成的丝状固定化青霉素酰化酶表现活力达 1 5 3U g(湿重 )。固定化酶合成头孢氨苄的最适pH为 6 5 ,最适温度为 40℃。 7 ADCA的投料浓度以 4%为好 ,7 ADCA与PGME的投料量比率为1∶2 ,最佳用酶量为 1 70U g 7 ADCA。在pH6 5、温度 3 0℃时 ,固定化酶对 7 ADCA的表观米氏常数K7 ADCA为 0 1 6 2mol L ,对PGME的表观米氏常数KPGME为 0 3 6 4mol L ,最大反应速度Vmax为0 0 4 6 2mol·L- 1·min- 1,用固定化酶合成头孢氨苄 ,使用 5 0次保留酶活力 83 9%     

固定化大肠杆菌AS1.76细胞酶促合成头孢立新的研究

本文报道固定化大肠杆菌(E.coli)AS1.76细胞酶促合成．的研究结果。用2％7一ADcA,4％。PGME,在pH6．0,10℃一15℃进行反应,头孢立新的合成率达到82％。在上述条件下,用固定化细胞柱制备头孢立新,每次投7-ADGA log,PGME 20g,平均得头孢立新12g,收率为70．6％。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶在新型环氧载体ZH-HA上的固定化

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶共价结合在新型环氧-氨基型载体ZH-HA 上,通过对酶浓度、固定化时间、pH以及缓冲液浓度等条件的考察,确定了最优固定化条件:50 mg比活力6000 U/g的巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶蛋白和1g ZH-HA悬浮于pH 9.01 mol/L磷酸缓冲液,室温搅拌6 h,制得固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶,活力2126 U/g湿载体,活力回收率7.67%.比较研究了固定化酶与原酶性质,原酶最适温度45℃,最适pH为8.0.固定化酶则分别是50℃和9.0,分别比溶液酶偏移5℃、1.0个pH单位.经过40批连续水解青霉素G钾盐,固定化巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶仍保持80%的活力,显示出良好的工作稳定性.     

酶法合成羟头孢霉素

本文报道具有青霉素酰化酶的大肠杆菌(E. coli PN-66)细胞酶促合成羟头孢霉素的研究结果。酶反应的最适温度为20℃,最适pH为6．0。羟头孢霉素的合成率随着母核7一氨基脱乙酰氧基头孢烷酸的浓度的增加而提高,随侧链对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐在与7一氨基脱乙酰氧基头孢烷酸的配比中的增加而提高。苯乙酸和苯氧乙酸对羟头孢霉素的合成有着强烈的抑制作用。在合适的条件下,羟头孢霉素的合成率可达90％以上。     

活性炭吸附固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶

目的：以活性炭为载体固定化粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶,考察固定化酶的性质。方法：对影响酶固定化的因素优化筛选,确定有显著影响的因素：pH、离子强度、酶量、固定化时间进行L934的正交实验,获得最佳固定化条件,并对固定化酶的最适反应温度、pH及批次稳定性进行研究。结果：最佳固定化条件为：载体0.3g,酶量5mL,总反应体系为12mL,离子强度1mol/L,温度4℃,pH 7.0,固定化40h;最高固定化酶活性为135.9U/g湿载体。固定化酶性最适反应温度为55℃,最适pH为10,重复使用12次后没有活性损失。结论：活性炭吸附固定化青霉素G酰化酶的活性高,批次反应稳定,具有工业应用潜力。     

以环氧乙烷为活性基的多孔颗粒状固定化青霉素酰化酶的制备

报道了用以环氧乙烷为活性基的多孔颗粒状载体（Eupergit-C）制备固定由巨大芽孢杆菌（B．megaterium）产生的青霉素酰化酶的研究。用已二胺,赖氨酸对载体进行化学修饰后制备固定化酶,获得了较好的固定结果。用未修饰的载体制备固化酶,经24h固定反应,酶活力达176．5IU／g（wet）,酶活力总叫率达53．7％,酶蛋白的固定量为19＝7mg/g（dr）,酶蛋白的固定效率达87．5％。游离酶的酶浓度对制备固定化酶的活力无显影响。当加酶量从312IU/g（dry）上升到6250IU／g（dry）时,固定化酶活力从89IU／g(wet）上升到475IU／g（wet）,总收率和固定化效率分别从99％和99％下降到26．5％和32．5％,酶蛋白的固定量从6．9mg/g（dry）上升到112mg/g（dry）,酶蛋白的固定效率从99％下降至80．5％。以酶活力为155IU/g(wet）,酶蛋白固定量为22mg/g(dry）的固定化酶水解青霉素G钾盐,经过20批循环水解后,剩余酶活力为92．5％。     

青霉素酰化酶在快速蛋白液相色谱仪上的分离纯化

由大肠杆菌AS1.76产生的青霉素酰化酶具有水解青霉素G产生6-APA,水解重排酸产生7-ADCA的作用,并且也具有合成青霉素类或头孢霉素类的作用。为了研究酶的物理化学性质,我们用Pharmacia FPLC系统对比酶进行了分离纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电     

温特曲霉转富马酸为L-苹果酸的初步研究*

从大量霉菌中选育到一株具有较高富马酸酶活性的温特曲霉(Aspergillus wentii) A5-61。在摇瓶培养条件下,32℃ 96小时,产L-苹果酸达10.49g/100ml,对富马酸的转化率达90.80%。利用菌体细胞,进行酶转化试验,结果表明：1.6g湿菌体接入25ml含富马酸10.0%（用NaOH中和至pH7.0）的转化液中,35℃16～24小时,连续转化三次,分别产生L—苹果酸9.61g/100ml、9.73g/100ml、6.93g/100ml。对菌体整体细胞酶学性质的研究表明,其最适反应温度35℃,最适反应pH7.0,Cu2＋对该酶有明显的抑制作用,该酶的Km＝0.154mol/L,Vmax＝0.0571mol/L·h。     

全细胞催化生产苯乙酰-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的条件优化

头孢类抗生素由于广谱性和低毒性被广泛用于细菌感染的治疗。7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-aminodeacetoxycephalosporanic acid,7-ADCA)作为半合成头孢类抗生素的重要中间体,需求量逐渐增加,而7-ADCA主要由G-7-ADCA(苯乙酰-7ADCA)脱酰基得到。工业上多以化学法合成G-7-ADCA,成本高,污染严重。迫切需要对环境友好且经济高效的合成方法。在前期研究中,构建了一株可以将青霉素G转化为G-7-ADCA的代谢工程菌(E.coli H7/PG15)。本研究通过单因素试验对E.coli H7/PG15的G-7-ADCA合成过程进行优化,包括底物组成及其最适浓度,转化条件(菌体浓度、p H、青霉素浓度、MOPS浓度、葡萄糖浓度,铁离子浓度和时间等)。优化后,建立了全细胞催化法生产G-7-ADCA的工艺流程,使G-7-ADCA的产量稳定在15 mmol/L左右,转化率达到30%,具有操作简便、高效和经济的优势。     

氨基酸酯水解酶产生菌的筛选及其合成头孢立新的研究

From ten genera and 146 bacterial strains, 22 strains producing alpha-amino acid ester hydrolase were selected. Among them, AS 1.586 and 41-2 were the best. The optimal conditions for synthesis of cephalexin by pseudomonas aeruginosa 1.204 were investigated. The optimal pH and temperature for enzymatic synthesis reaction was pH 6.8 and 25 degrees C, respectively. By using 1% 7-ADCA, 3% PGME and 4% biomass, about 70% of 7-ADCA was converted to cephalexin under the mentioned conditions.     

非水体系中脂肪酶催化合成乳酸乙基糖苷酯的工艺研究

在非水体系中 ,通过固定化脂肪酶催化合成一种新型α 羟基酸衍生物 乳酸糖苷酯。考察了常压下有机溶剂、酰基供体、不同种固定化酶、乙基糖苷的浓度、酶量和反应温度对反应的影响。研究表明在无溶剂体系中以乳酸丁酯作为酰基供体可有效地合成乳酸糖苷酯 ,固定化酶Novozym435和来源于Candida sp .菌株的细胞固定化酶 ,化学修饰的干酶粉均是合适的催化剂。最佳反应条件为 :酶浓度 75g L ,乙基葡萄糖苷的浓度为 0.4mol L ,温度为 70℃ ,转速 200r min ,反应 50h ,转化率可达 71%。在真空度为 0.09MPa的压力下 ,反应温度 65℃ ,酶浓度 75g L ,乙基葡萄糖苷 0.35mol L时 ,反应初速率可达到 607(mmol·L^-1·h^-1 ) ,40h后转化率可达到 90%。反应产物经过萃取法和硅胶柱层析方法分离 ,纯度达到 95 % (W/W)。     

Equilibrium position, kinetics, and reactor concepts for the adipyl-7-ADCA-hydrolysis process

One of the building blocks of cephalosporin antibiotics is 7-amino-deacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA). It is currently produced from penicillin G using an elaborate chemical ring-expansion step followed by an enzyme-catalyzed hydrolysis. However, 7-ADCA-like components can also be produced by direct fermentation. This is of scientific and economic interest because the elaborate ring-expansion step is performed within the microorganism. In this article, the hydrolysis of the fermentation product adipyl-7-ADCA is studied. Adipyl-7-ADCA can be hydrolyzed in an equilibrium reaction to adipic acid and 7-ADCA using glutaryl-acylase. The equilibrium reaction yield is described as a function of pH, temperature, and initial adipyl-7-ADCA concentration. Reaction rate equations were derived for adipyl-7-ADCA-hydrolysis using three (pH-independent) reaction rate constants and the apparent equilibrium constant. The reaction rate constants were calculated from experimental data. Based on the equilibrium position and reaction rate equations the hydrolysis reaction was optimized and standard reactor configurations were evaluated. It was found that equilibrium yields are high at high pH, high temperature and low-initial adipyl-7-ADCA concentration. The course of the reaction could be described well as a function of pH (7-9), temperature (20-40 degrees C) and concentration using the reaction rate equations. It was shown that a series of CSTR's is the best alternative for the process.     

大肠杆菌EP8—10转化苯丙酮酸生成L—苯丙氨酸的研究

E. coli EP8-10 was selected from the soil. It was able to produce the transaminase with high activity when it was cultivated on the medium containing peptone and beef extract. Optimum conditions of enzyme reaction was: phenylpyruvic acid's concentration of 0.3-0.5 mol/L, L-Asptaric acid used as amino donor, pH 8.5 37 degrees C. When phenylpyruvic acid was 0.3 mol/L, 48 g/L L-phenylalanine was produced after 6 h with 97% conversion rate.     

酿酒酵母突变株J-X25胞内合成GSH的研究

以筛选得高产谷胱甘肽(GSH)产生酵母甲硫氨酸缺陷型变株J-X25为试验菌株。对其培养条件进行研究,结果表明：发酵培养基的最适初始pH值为6.0、最佳发酵温度为30℃、最佳装液量为100ml/500ml、接种量10%、摇床转速为220r/min。在酵母细胞培养到对数期,加入过氧化氢刺激细胞发生应激反应和乳酸钠作为表面活性剂改变细胞通透性,GSH总量达到0.253g/L,比不添加两者情况下的GSH产量高出52％。结果表明优化培养条件后,J-X25胞内积累GSH比出发株提高79％。     

Performance characteristics of a two-stage dark fermentative system producing hydrogen and methane continuously

The performance of a mesophilic two-stage system generating hydrogen and methane continuously from sucrose (10-30 g/L) was investigated. A hydrogen-generating CSTR followed by an upflow anaerobic filter were both inoculated with anaerobically digested sewage sludge, and ORP, pH, gas output, %H(2), %CH(4) and %CO(2) monitored. pH was controlled with NaOH, KOH or Ca(OH)(2). Using NaOH as alkali with 10 g/L sucrose, yields of 1.62 +/- 0.2 mol H(2)/mol hexose added and 323 mL CH(4)/gCOD added to the hydrogen and methane reactors respectively were achieved. The overall chemical oxygen demand (COD) reduction was 92.6% with 0.90 +/- 0.1 g/L sodium and 316 +/- 40 mg/L residual acetate in the methane reactor. Operation at 20 g/L sucrose and NaOH as alkali led to impaired volatile fatty acid (VFA) degradation in the methane reactor with 2.23 +/- 0.2 g/L sodium, 1,885 mg/L residual acetate, a hydrogen yield of 1.47 +/- 0.1 mol/mol hexose added, a methane yield of 294 mL/gCOD added and an overall COD reduction of 83%. Using Ca(OH)(2) as alkali with 20 g/L sucrose gave a hydrogen yield of 1.29 +/- 0.3 mol/mol hexose added, a methane yield of 337 mL/gCOD added and improved the overall COD reduction to 91% with residual acetate concentrations of 522 +/- 87 mg/L. Operation at 30 g/L sucrose with Ca(OH)(2) gave poorer overall COD reduction (68%), a hydrogen yield of 1.47 +/- 0.2 mol/mol hexose added, a methane yield of 138 mL/gCOD added and residual acetate 7,343 +/- 715 mg/L. It was shown that sodium toxicity and overloading are important issues for successful anaerobic digestion of effluent from biohydrogen reactors in high rate systems.     

培养条件对头孢霉菌丝体脂肪酸组分的影响

研究了头孢霉(Cephalosporium sp.)菌丝体最大生产力和多不饱和脂肪酸形成积累的条件。菌丝体最适培养条件为：麦芽糖60g/L\,KNO33g/L、起始pH为60、500mL三角瓶装100mL培养基、接种25%、25℃培养10d则菌丝体达到最大干重。多不饱和脂肪酸形成积累的最适条件为：葡萄糖10～20g/L、(NH4)2SO4或NH4Cl 3g/L、培养基起始pH为40、500mL三角瓶装100mL培养基、接种10%～20%、10℃下照光培养。〖JP2〗因此,在整个生产流程中可采用不同条件分段掌握的技术原则。同时提出在多不饱和脂肪酸的形成和积累途径中油酸(18∶1)向亚油酸(18∶2)的转化是关键,为进一步探索最适培养条件和关键酶的调节提供依据。