基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展

数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术．该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应,通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数．DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定量DNA拷贝数的关键因素．本文综述了数字PCR的发展历史、数字PCR与实时荧光定量PCR的区别,以及数字PCR在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的最新进展,并展望了该技术的应用前景．     

数字PCR定量检测血浆中环状RNA方法的建立

生物标志物一直是医学领域的研究热点.目前主要以实时荧光定量PCR技术作为分子诊断的检测手段,用于大样本的核酸检测,但该技术具有限制性,会导致假阴性.作为第三代PCR的数字PCR技术,优化并提高了检测灵敏度,无需标准曲线实现绝对定量检测,大大提高了检测的精准度,尤其是对于低表达RNA的检测,显得更为出色.本研究以hsa_circ_0061276为例,利用微滴式数字PCR EvaGreen染料法对血浆中hsa_circ_0061276的拷贝数进行绝对定量地检测,成功检测出胃炎和胃癌患者血浆中hsa_circ_0061276的具体拷贝数.因此,数字PCR作为新型检测技术在临床实际应用中有较大推广价值.     

数字聚合酶链反应及其在感染性疾病中的应用

数字聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)采用与定量PCR相同的荧光化学原理和不同的数学原理来实现对靶标核酸序列的绝对定量,其摒弃了对外部参照的依赖,同时具有更高的数据精密度,提高了重复性和再现性。数字PCR的应用涵盖生命科学众多领域,特别是在医学检验领域,其对疾病相关核酸分子标记的准确分析,为疾病的早期诊断、进展监测、疗效评估提供了动态量化指标。数字PCR的出现将推动基于核酸扩增技术的分子生物学检测迈入精准定量阶段。本文就数字PCR尤其是微滴式数字PCR在感染性疾病中的应用进展及前沿进行综述。     

数字PCR技术原理及应用

数字PCR(d PCR)是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的核酸定量分析技术。该技术先将核酸模板进行稀释,分配到大量独立的反应单元中,使每个反应单元中只有单个模板分子,然后进行PCR扩增反应,扩增结束后对每个反应室的荧光信号进行统计学分析,来定量DNA拷贝数。数字PCR采用先扩增后定量,因此不依赖扩增曲线的循环阈值(Ct),也无需采用内参基因和标准曲线,准确度高、重现性好,可以实现绝对定量分析。由于其独特的技术优势,已经在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达分析、环境微生物检测和下一代测序等研究领域显示出巨大的优势和应用前景。本文对数字PCR技术原理、定量分析方法、系统分类和应用等进行概述。     

数字PCR技术及其在检测领域的应用

随着分子生物学技术的不断发展和需求的多样化,用于核酸检测的各种PCR衍生技术应运而生。数字PCR是一种单分子水平的大规模分区扩增定量核酸检测技术。该技术以微腔室/微孔或微滴作为PCR反应器,无需校准物和绘制标准曲线即可实现对样品初始浓度的绝对定量,具有高灵敏度、高特异性和高精确度的特点。本文详细介绍了数字PCR的技术发展史、作用原理以及仪器平台类型,系统阐述了数字PCR在转基因检测、疾病诊断、环境及食品监管等方面的应用概况,并对该技术的应用前景进行了展望,以期对未来数字PCR的开发利用提供参考。     

阪崎肠杆菌核酸提取纯化方法分析比较

阪崎肠杆菌是一种食源性致病菌,目前越来越多的分子检测技术用于该菌的检测,以取代传统的检测技术。针对分子检测技术相应的核酸标准物质的研制势在必行。核酸的提取和纯化是核酸标准物质的研制过程中的重要环节之一,快速高效高质量,低毒低成本已成为核酸提取的重要目标。就现有方法进行分析比较,重点对常用的三种提取微生物基因组DNA的试剂盒进行了全方位比较,获得了阪崎肠杆菌较优的基因组DNA提取方法,并对提取的DNA进行PCR特异性扩增检测,获得较清晰的谱带。为阪崎肠杆菌核酸标准物质的研制奠定了基础。     

数字PCR技术及应用研究进展

数字PCR是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室,PCR扩增反应后,对荧光信号进行检测分析,实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖,具有更高灵敏度和准确度,在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测、转基因食品检测以及下一代测序等方面均得到广泛应用。本文介绍数字PCR技术的定量方法,并评述该技术在主要应用领域的研究进展。     

基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立。本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的最佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7~8.22"104拷贝/#L,检测的检出限为3.77拷贝/反应。微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术。     

基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用北大核心CSCD

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立。本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的最佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7~8.22"104拷贝/#L,检测的检出限为3.77拷贝/反应。微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术。     

同步PCR技术及其在植物核酸分子定量中的应用

同步PCR是一种集生化、光电和计算机技术于一体的封闭式DNA扩增系统,采用荧光染料将扩增与检测过程结合在一起,实现了在PCR过程中在线显示PCR反应,通过检测荧光强度来绝对定量起始模板的拷贝数.该技术大大简化和加速了核酸分子的定量过程,不仅快速、灵敏、准确、重复性好,而且很容易计算出待测样品中核酸分子的绝对起始拷贝数.同微阵列等分子生物技术一起,同步PCR技术将会在功能基因解析和病害分子诊断等方面发挥重要作用.本综述除了介绍同步PCR技术的原理和应用外,还介绍了定量拟南芥Aux/IAA基因的转录水平的实验,并就同步PCR操作过程中的问题进行了讨论.     

HPV核酸检测标准物质研究进展

2018年全球癌症统计数据显示,我国宫颈癌发病率已高居世界第二位,且有发病年轻化的趋势,严重威胁着女性的身体健康。已有研究表明：高危型人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染与宫颈癌的发生密切相关。针对HPV的检测对于宫颈癌的预防和诊断具有重要的意义,目前常见的检测方法是基于PCR技术,对HPV的核酸进行定性和定量分析。然而在缺乏统一标准的情况下,难以保证测量结果准确可比。标准物质作为计量校准的有力工具,可以应用于测量过程的质量控制。讨论了针对HPV的常见检测方法与检测过程中的影响因素,分析了不同形式核酸标准物质和参考品的特点,以期为HPV核酸检测标准物质的研制和使用提供参考,以用于宫颈癌的科学诊断。     

数字PCR仪校准方法研究

数字PCR仪是核酸绝对定量的重要仪器,因此确保数字PCR仪检测结果的准确性十分重要。通过对国内市场上数字PCR仪的比较分析,剖析了数字PCR仪的性能指标,对数字PCR仪的校准方法进行了探讨,设定了拷贝数浓度相对示值误差、拷贝数浓度重复性、荧光通道一致性和反应单元个数重复性作为数字PCR仪整机校准的计量技术指标,采用具有溯源性的国家有证标准物质,对方法进行了试验验证。验证结果表明了校准思路和方法的可行性,该方法操作性强,能够满足仪器技术要求以及用户需求, 提高了数字PCR仪检测结果的准确性和可靠性,对进一步拓展和深化数字PCR 技术的应用具有积极的促进作用。     

基于数字PCR的不同品种鸭组织中线粒体与核DNA拷贝数差异研究

肉和肉制品是人类生活的重要营养来源,但近年来肉制品中发生的掺假使假事件屡见不鲜,使得肉品的质量安全问题已经成为全世界关注的热点话题。以核酸为目标的动物源鉴定是当前普遍使用的方法。在核酸检测中,常用线粒体基因或核基因作为靶标,缺乏统一标准。以绍兴鸭和北京鸭等不同品种及生鲜组织(鸭血、鸭胸肉、鸭肝、鸭皮、鸭心和鸭腿肉)为实验材料,提取DNA后利用微滴式数字PCR开展线粒体和核DNA拷贝数的比较研究,以两者拷贝数及其比值的变异系数为判定依据。结果显示,核DNA的拷贝数在不同品种鸭组织间相对稳定,且变异系数小于线粒体DNA,表明核DNA是开展鸭肉制品掺假定量检测的最适DNA来源。鸭腿肉中线粒体/核DNA拷贝数比值的变异系数最小,表明线粒体DNA作为靶基因的鸭肉掺假比例定量检测时,鸭腿肉来源的肉制品是最佳选择。     

癌症液体活检新思路：数字PCR检测DNA甲基化

癌症的早期诊断可提高患者生存率.微创采集人体体液的液体活检方法可避免传统肿瘤组织活检方法侵入性和异质性的问题,逐渐成为癌症诊断的新方式.另外,DNA甲基化作为预测癌症发生发展的标志物,引起了越来越多研究者的关注.但传统DNA甲基化的检测方法灵敏度不高,且容易出现假阳性.近年来,数字PCR技术因其超高的检测灵敏度和精确度、无需标准曲线即可进行核酸绝对定量检测的优势,被用于DNA甲基化的定量检测中.本文首先介绍了DNA甲基化与癌症发生发展的关系,总结了传统DNA甲基化检测方法及其在癌症临床诊断中的应用,阐述了基于不同核酸样本分散方法的数字PCR技术及其在微量DNA甲基化检测中的优势,总结了采用数字PCR技术检测癌症患者体液中DNA甲基化的具体步骤,列举了数字PCR技术在癌症DNA甲基化检测中的研究成果及应用进展,最后提出了数字PCR技术检测癌症DNA甲基化未来可能面临的挑战,并对数字PCR技术在癌症液体活检方面的应用前景进行了展望.     

Comparison of droplet digital PCR with quantitative real-time PCR for determination of zygosity in transgenic maize

This study evaluated the applicability of droplet digital PCR (ddPCR) as a tool for maize zygosity determination using quantitative real-time PCR (qPCR) as a reference technology. Quantitative real-time PCR is commonly used to determine transgene copy number or GMO zygosity characterization. However, its effectiveness is based on identical reaction efficiencies for the transgene and the endogenous reference gene. Additionally, a calibrator sample should be utilized for accuracy. Droplet digital PCR is a DNA molecule counting technique that directly counts the absolute number of target and reference DNA molecules in a sample, independent of assay efficiency or external calibrators. The zygosity of the transgene can be easily determined using the ratio of the quantity of the target gene to the reference single copy endogenous gene. In this study, both the qPCR and ddPCR methods were used to determine insect-resistant transgenic maize IE034 zygosity. Both methods performed well, but the ddPCR method was more convenient because of its absolute quantification property.