miR-125b-5p对人血管瘤内皮细胞HemES增殖和凋亡的影响及其机制

目的: 研究miR-125b-5p 对人血管瘤内皮细胞HemECs增殖、凋亡的影响。方法: RT-qPCR检测人血管瘤内皮细胞HemECs及其旁系组织细胞中miR-125b-5p与MCL-1 mRNA的表达;选取HemECs细胞分为对照组、miR-NC组、miR-125b-5p mimic组、miR-125b-5p inhibitor组、pc-MCL-1组、miR-125b-5p+ pc-MCL-1组,每组设9复孔。将100 nmol · L^-1 的miR-NC、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p inhibitor 、pc-MCL-1质粒分别或联合转染进入HemECs细胞。MTT法检测HemECs细胞增殖;流式细胞术检测HemECs细胞凋亡; 双荧光素酶报告检测靶向关系;蛋白印迹法检测Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-p70s6k/ p70s6k、p-AKT/AKT、p-mTOR/ mTOR蛋白相对表达水平。结果: 通过比较miR-125b-5p在血管瘤组织和细胞中的表达水平,选择下调效果比较明显的HemECs细胞系进行后续实验。与对照组相比,miR-125b-5p mimic组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显减少(P＜0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显升高、Bcl-2表达明显降低(P＜0.01),p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显下调(P＜0.01);miR-125b-5p inhibitor组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显增加(P＜0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显降低、Bcl-2表达升高(P＜0.05,P＜ 0.01)。miR-125b-5p靶向下调MCL-1。与miR-125b-5p mimic组相比,miR-125b-5p+ pc-MCL-1组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显增加(P＜0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显降低、Bcl-2表达明显升高(P＜0.01), p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显上调(P＜0.01)。结论: miR-125b-5p抑制人血管瘤内皮细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能与靶向下调MCL-1表达,抑制AKT / mTOR通路激活等有关。     

Mir-335-5p靶向G6PD对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

目的: 探讨Mir-335-5p通过靶向G6PD对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响。方法: 设置正常结肠细胞组、空白对照组、NC组、miRNA-335-5p mimic组;体外培养结肠上皮细胞(IEC)和人源性结肠癌细胞SW480,并对NC组、miRNA-335-5p mimic组细胞进行转染;采用RT-qPCR检测各组细胞中miR-335-5p及G6PD mRNA表达水平;双荧光素酶报告实验验证Mir-335-5p对G6PD靶向作用;MTT实验检测各组细胞的增殖;流式细胞术检测转染后各组细胞凋亡率;Western blot检测G6PD及凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase3相对表达水平。结果: 与正常结肠细胞相比,空白对照组、NC组结肠癌细胞SW480细胞中miR-335-5p相对表达水平降低,G6PD mRNA相对表达水平升高(P＜0.05);与空白对照组、NC组相比,miR-335-5p mimic组细胞miR-335-5p表达水平明显升高,G6PD mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)。与空白对照、NC组相比,miR-335-5p mimic组结肠癌SW480细胞生长活性显著降低,凋亡率显著升高(P＜0.05)。miR-335-5p mimic+WT-G6PD 3′-UTR组的荧光素酶相对活性低于miR-335-5p NC+WT-G6PD 3′-UTR组(P＜0.05)。与空白对照组相比,miR-335-5p mimic组细胞中G6PD、Bcl-2蛋白相对表达水平显著降低,Bax、caspase3蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)。结论: Mir-335-5p可能通过靶向G6PD抑制结肠癌细胞增殖、促进凋亡。     

过表达miR-31对结肠炎模型小鼠TLR4/NF-κB信号通路及凋亡蛋白的调控

目的: 探讨miR-31对DSS诱发结肠炎小鼠TLR4/NF-κB信号通路和凋亡相关蛋白的影响。方法: ①小鼠结肠炎实验:用1%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发小鼠溃疡性结肠炎(UC)。14只FVB非转基因小鼠随机分为control组(n=6),DSS组(n=8),16只FVB miR-31转基因小鼠随机分为miR-31过表达组(n=8),miR-31过表达+DSS 组(n=8),DSS溶于水后通过饮水给予小鼠。DSS组和miR-31+DSS组第一周饮用1%DSS水,第二周饮用正常无菌水,第三周饮用1%DSS水,如此5周后造模完成,之后留取小鼠的结肠组织,通过Western blot和IHC检测小鼠结肠组织NF-κB p65、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白的表达;TUNEL检测小鼠结肠组织细胞凋亡。②细胞培养实验:在人结肠上皮细胞系HCT 116细胞中通过脂质体转染的方法转染miR-31 mimic和inhibitor,使miR-31过表达或敲低,每组均进行三次重复,48 h后收取细胞,通过Western blot检测NF-κB p65、TLR4蛋白的表达。结果: ①动物实验中,与control组相比,小鼠结肠组织中DSS组和miR-31过表达组NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平和凋亡细胞指数均显著升高(P＜0.05或P＜0.01),Bcl-2/Bax比值显著降低(P＜0.05或P＜0.01);且与DSS组相比,miR-31+DSS组NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平和凋亡细胞指数也显著升高(P＜0.01),Bcl-2/Bax比值显著降低(P＜0.01)。②细胞实验中,与control组相比, HCT 116细胞过表达miR-31组的NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05或P＜0.01),敲低miR-31组的NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平下降(P＜0.05)。结论: miR-31通过促进TLR4/NF-κB信号通路和介导肠上皮细胞凋亡促进结肠炎的发展。     

miR-520a-3p调控宫颈癌细胞因子分泌的信号通路*

目的: 探讨miR-520a-3p调控宫颈癌细胞因子分泌的分子机制。方法: 通过TargetScanHuman分析miR-520a-3p与NF-κB复合体亚基RELA的匹配情况,然后通过荧光素酶报告系统检测miR-520a-3p是否靶向NF-κB复合体亚基RELA;使用LPS刺激宫颈癌HELA细胞后,将miR-520a-3p mimics与转染试剂混合后滴入HELA细胞中,此为过表达组;将miR-520a-3p inhibitor与转染试剂混合后滴入HELA细胞中,此为敲低组,通过酶联免疫吸附试验检测过表达组和敲低组GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNFα的表达水平。每次实验重复3次。结果: miR-520a-3p靶向RELA的3’UTR;LPS激活NF-kB信号通路后,宫颈癌HELA细胞分泌的细胞因子GCSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MCP-5, RANTES, TNFα的蛋白表达水平上升(P＜0.05);过表达组中NF-κB复合体亚基RELA的蛋白表达水平下降,宫颈癌HELA细胞分泌的上述细胞因子的蛋白表达水平下降(P＜0.05);敲低组中NF-κB复合体亚基RELA的蛋白表达水平上升,宫颈癌HELA细胞分泌的上述细胞因子的蛋白表达水平上升(P＜0.05)。结论: miR-520a-3p通过靶向NF-κB信号通路的关键分子RELA抑制宫颈癌HELA细胞的细胞因子分泌。     

miR-670-5p对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的: 探讨miR-670-5p对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,分析其调控WW结构域氧化还原酶基因(WWOX)的机制。方法: 收集2016年1月至2017年10月收治的28例肺癌组织和对应癌旁组织,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肺癌组织、癌旁组织中miR-670-5p的表达水平。将肺癌细胞A549分为anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-670-5p组(转染anti-miR-670-5p)、anti-miR-670-5p+si-NC组(转染anti-miR-670-5p与si-NC)、anti-miR-670-5p+si-WWOX组(转染anti-miR-670-5p与si-WWOX)。转染48 h后,RT-qPCR或蛋白质印记(Western blot)检测转染效果。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测P21、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-670-5p和WWOX的靶向关系。结果: 肺癌组织中miR-670-5p的表达水平较癌旁组织显著升高(P＜0.05)。抑制miR-670-5p可抑制MMP-2蛋白表达(P＜0.05),促进P21和E-cadherin表达(P＜0.05),抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭(P＜0.05)。WWOX是miR-670-5p的靶基因,miR-670-5p负调控WWOX表达。抑制WWOX可部分逆转anti-miR-670-5p对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响(P＜0.05)。结论: miR-670-5p通过靶向WWOX能够促进肺癌细胞增殖、迁移、侵袭。     

miR-133b靶向抑制SGTB对oxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响*

目的:探讨微小RNA-133b(miR-133b)靶向抑制富含谷氨酰胺三十四肽重复序列的小蛋白质分子(SGTB)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法:采用100 μg/ml的oxLDL诱导人脐静脉血管内皮细胞(EVC-304)24 h构建血管内皮细胞损伤模型。将EVC-304细胞分为对照组、oxLDL组(oxLDL处理)、oxLDL+miR-NC组(转染20 nmol/L miR-NC+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b组(转染20 nmol/L miR-133b mimics+oxLDL处理)、oxLDL+si-NC组(转染20 nmol/L si-NC+oxLDL处理)、oxLDL+si-SGTB组(转染20 nmol/L si-SGTB+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b+pcDNA组(转染20 nmol/L si-SGTB和pcDNA+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b+pcDNA-SGTB组(转染20 nmol/L si-SGTB和pcDNA-SGTB处理)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印记(Western blot)检测miR-133b和SGTB的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;试剂盒检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性;Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-133b对SGTB的靶向调控关系。结果:与对照组比较,oxLDL诱导后EVC-304细胞miR-133b、Bcl-2的表达水平显著降低(P＜0.05),SGTB、Bax的表达水平显著升高(P＜0.05),MDA含量和细胞凋亡率显著增加(P＜0.05),SOD和GSH-Px活性显著降低(P＜0.05)。过表达miR-133b或干扰SGTB均可抑制oxLDL诱导的EVC-304细胞凋亡和氧化应激损伤(P＜ 0.05)。miR-133b与SGTB直接结合,过表达miR-133b显著下调SGTB表达(P＜0.05),抑制miR-133b显著上调SGTB表达(P＜0.05)。过表达SGTB可逆转过表达miR-133b对oxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响(P＜0.05)。结论:miR-133b通过靶向抑制SGTB的表达,可减轻oxLDL诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。     

miR-27a-3p通过靶向Sema7A调控病毒性心肌炎心肌细胞损伤的机制研究

目的探讨微小RNA-27a-3p(miR-27a-3p)过表达对病毒性心肌炎(VMC)细胞损伤的影响及其可能的作用机制。方法原代培养大鼠心肌细胞,柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞建立VMC模型(CVB3组)。正常心肌细胞作为对照组,分别将miR-NC、miR-27a-3p mimics、si-NC,si-Sema7A分别转染至CVB3感染的心肌细胞,记为CVB3+miR-NC组、CVB3+miR-27a-3p组、CVB3+si-NC组、CVB3+si-Sema7A组。分别将miR-27a-3p mimics与pcDNA,miR-27a-3p mimics与pcDNA-Sema7A共转染至CVB3感染的心肌细胞,记为CVB3+miR-27a-3p+pcDNA组、CVB3+miR-27a-3p+pcDNA-Sema7A组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与Western blot法分别检测细胞中miR-27a-3p、信号蛋白7A(Sema7A)的表达水平;流式细胞术检测miR-27a-3p过表达或干扰Sema7A表达后心肌细胞的凋亡率;酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)的含量;双荧光素酶报告基因验证miR-27a-3p与Sema7A的靶向关系;Western blot检测B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达。两组间比较采用独立样本t检验。结果与对照组比较,CVB3组miR-27a-3p的表达水平(1.01±0.09比0.42±0.04)降低,Sema7A的mRNA和蛋白表达水平(1.02±0.09比2.15±0.21、0.43±0.04比0.94±0.09)升高,TNF-α、IL-1水平[(403.56±38.16)pg/mL比(1156.48±63.59)pg/mL>(29.45±3.54)pg/mL比(136.57±12.47)pg/mL]升高,细胞凋亡率[(5.36±0.54)%比(24.58±2.14)%]升高,Bax、cleaved caspase-3的表达水平升高,Bcl-2的表达水平降低(P均<0.05);与CVB3+miR-NC组比较,CVB3+miR-27a-3p组TNF-α,IL-1水平[(1187.69±71.42)pg/mL比(516.28±48.31)pg/mL、(147.25±14.05)pg/mL比(43.68±5.02)pg/mL]和细胞凋亡率[(26.38±2.55)%比(10.24±1.15)%]降低,Bax、cleaved caspase-3表达水平降低,Bcl-2表达水平升高(P均<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-27a-3p可靶向调控Sema7A的表达;Sema7A过表达可逆转miR-27a-3p过表达对CVB3诱导的VMC细胞损伤的作用。结论miR-27a-3p过表达可降低VMC细胞中炎症因子的表达及抑制细胞凋亡从而减轻心肌损伤,其作用机制可能与靶向调控Sema7A的表达有关。     

miR-216a-5p调控HMGB1参与膀胱癌EJ细胞生物学行为的机制探讨

[目的]探究微小RNA(microRNA,miR)-216a-5p靶向高迁移率族蛋白1(HMGB1)调控膀胱癌细胞的增殖、凋亡和侵袭的机制。[方法]通过双荧光素酶报告验证miR-216a-5p与HMGB1的靶向关系。人膀胱癌细胞分为4组：对照组、miR-216a-5p组、HMGB1组和miR-216a-5p+HMGB1组。通过转染miR-216a-5p类似物和/或HMGB1质粒来提高miR-216a-5p和/或HMGB1的水平。检测各组miR-216a-5p和HMGB1蛋白表达水平,以及细胞增殖、凋亡和侵袭能力。[结果] miR-216a-5p与HMGB1在膀胱癌细胞中的靶向结合(P<0.05)。HMGB1蛋白及其细胞的增殖及侵袭水平在miR-216a-5p组中明显较对照组低,凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。HMGB1组的HMGB1蛋白、增殖和侵袭水平显著高于对照组,凋亡率显著低于对照组(P<0.05)。miR-216a-5p+HMGB1组的HMGB1蛋白、增殖和侵袭水平显著高于miR-216a-5p组且显著低于HMGB1组,凋亡率显著低于miR-216a-5p...     

上调miR-216a-5p通过靶向双特异性磷酸酶10抑制胃癌细胞自噬并增强放射敏感性

摘要 目的：探究miR-216a-5p对胃癌细胞自噬和放射敏感性的调控机制及其对双特异性磷酸酶10（DUSP10）的调控作用。方法：采用直线加速器6-MV X射线照射SGC-7901细胞,剂量率为0.8Gy/min,总剂量为8Gy。用Lipofectamine 2000试剂将miR-216a-5p mimic、NC mimic、pcDNA DUSP10或pcDNA NC转染到SGC-7901细胞中。转染后,将细胞分为miR-216a-5p mimic组和NC mimic组,每组又分为0Gy和8Gy两个亚组。在拯救实验中,将细胞分为miR-216a-5p mimic+pcDNA DUSP10组和miR-216a-5p mimic+pcDNA NC组。通过qRT-PCR检测miR-216a-5p和DUSP10 mRNA水平。通过5-乙炔基-2''-脱氧尿苷（EdU）掺入实验和集落形成测定检测细胞增殖。通过流式细胞仪评估细胞凋亡。通过Western blot检测DUSP10、Bax、Bad、Bcl-2、LC3和p62的蛋白表达。通过免疫荧光法检测γH2AX的表达,用于评估细胞中的DNA双链断裂（DSB）。通过荧光素酶报告基因检测miR-216a-5p和DUSP10的靶向关系。通过GFP-mRFP-LC3检测自噬体。结果：与8Gy NC-mimic组相比,8Gy miR-216a-5p-mimic组的集落数量、EdU阳性率和Bcl-2蛋白表达水平降低,而γH2AX阳性率、细胞凋亡率和Bax和Bad蛋白表达水平升高（P<0.01）。与8Gy NC-mimic组相比,8Gy miR-216a-5p-mimic组的自噬体数量和LC3II蛋白表达水平降低,而p62蛋白表达水平升高（P<0.001）。与miR-216a-5p-mimic共培养后,与DUSP10-3''-UTR-MUT组相比,DUSP10-3''-UTR-WT的相对荧光素酶活性显著降低（P<0.001）。与NC-mimic组相比,miR-216a-5p-mimic组的DUSP10 mRNA和蛋白表达水平均降低（P<0.001）。与miR-216a-5p mimic+pcDNA NC组相比,miR-216a-5p mimic+pcDNA DUSP10组的集落数量和自噬体数量升高,而细胞凋亡率降低（P<0.001）。结论：miR-216a-5p通过抑制DUSP10来抑制细胞增殖、增加放射诱导的细胞凋亡并抑制放射诱导的自噬,从而增强胃癌细胞的放射敏感性。     

miR-34a-5p对三阴性乳腺癌细胞的影响及相关机制研究*

目的: 探讨miR-34a-5p在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)中的表达,分析miR-34a-5p对TNBC细胞增殖、凋亡、迁移的作用,对TNBC荷瘤小鼠肿瘤生长的影响以及在TNBC中对B7-H1表达的影响。方法: 利用RT-qPCR、Western blot分析TNBC细胞中miR-34a-5p、B7-H1的表达,并利用Kaplan-Meier分析二者的表达与TNBC患者的生存关系;将miR-34a-5p转染TNBC细胞,通过CCK-8、流式细胞术及划痕实验检测miR-34a-5p对TNBC细胞增殖、凋亡、迁移的影响;利用RT-qPCR、Western blot检测miR-34a-5p、B7-H1表达水平的变化,双荧光素酶基因报告验证miR-34a-5p与B7-H1的相互作用;利用RT-qPCR、Western blot、IHC检测miR-34a-5p对MDA-MB-231荷瘤小鼠miR-34a、B7-H1表达的影响。结果: TNBC细胞中miR-34a-5p呈低表达,B7-H1呈高表达,二者均与TNBC患者的不良预后有关,差距具有统计学意义(P<0.01);miR-34a-5p抑制TNBC细胞增殖、侵袭,促进细胞凋亡,并且在TNBC细胞中靶向抑制B7-H1;miR-34a-5p agomir在体内抑制MDA-MB-231成瘤裸鼠的肿瘤生长和B7-H1表达。结论: miR-34a-5p在TNBC发生、发展中发挥着重要作用,靶向miR-34a-5p/B7-H1可能成为TNBC患者新的分子治疗策略。     

抗阻训练对增龄大鼠骨骼肌线粒体功能的影响*

目的: 从线粒体动力学的角度,探讨抗阻运动对增龄大鼠骨骼肌线粒体功能的影响。方法: 40只雄性SD大鼠随机分为4组:2月龄安静对照组(C1组)、2月龄抗阻运动训练组(R1组)、6月龄安静对照组(C2组)、6月龄抗阻运动训练组(R2组),每组10只。C1、C2组正常喂养,R1、R2组大鼠进行跑台坡度为35°,速度为15 m/min的抗阻运动,一次跑动15 s,间歇30 s,4次为一组,组间间歇3 min,3组为一次循环,一天为2个循环,循环间歇10 min,每周6 d,共8周。采用Western blot法测定各组大鼠股四头肌线粒体融合蛋白2(Mfn2)、GTP酶1(DRP1) 蛋白含量,使用流式细胞仪测定各组大鼠股四头肌线粒体膜电位(ΔΨm)、活性氧(ROS)和游离钙(Ca²⁺)水平。结果: ① 与C1组相比,R1组大鼠DRP1蛋白升高(P＜0.01)、Mfn2蛋白无显著变化,C2组大鼠DRP1、Mfn2蛋白均降低(P均＜0.01);与C2组相比,R2组大鼠DRP1、Mfn2蛋白均升高(P＜0.01,P＜0.05);与R1组相比,R2组DRP1、Mfn2蛋白均降低(P＜0.01,P＜0.05)。② 与C1组相比,R1组Ca²⁺含量降低(P＜0.01)、C2组Ca²⁺含量升高(P＜0.01);与C2组相比,R2组Ca²⁺含量降低(P＜0.01);与R1组相比,R2组Ca²⁺含量升高(P＜0.01)。③ 与C1组相比,R1组ROS含量有所上升,但无显著性差异,C2组ROS含量升高(P＜0.01);与C2组相比,R2组ROS含量降低(P＜0.01);与R1组相比,R2组ROS含量升高(P＜0.01)。④ 与C1组相比,C2组ΔΨm降低(P＜0.01);与C2组相比,R2组ΔΨm升高(P＜0.01);与R1组相比,R2组ΔΨm有所降低,但无统计学差异。结论: 大鼠增龄过程中股四头肌线粒体出现Ca²⁺堆积、活性氧增多、线粒体膜电位下降、融合蛋白减少等现象,抗阻训练可有效改善这些变化。     

低氧条件下奥巴克拉联合吉西他滨对乳腺癌细胞的作用

目的: 研究在低氧条件下,奥巴克拉(OBX)联合吉西他滨(GEM)对乳腺癌细胞MCF-7、BT-20的细胞活性、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法: 选取乳腺癌细胞MCF-7与BT-20细胞,分组为正常氧组,低氧组,GEM组,OBX+GEM组。正常氧组:37℃,5% CO₂培养箱培养24 h与48 h;低氧组:37℃,1%O₂,5% CO₂ ,94% N₂条件下培养24 h与48 h; GEM组:37℃,1%O₂,5% CO₂ , 94% N₂,加入终浓度为10 μmol/L的GEM培养24 h与48 h;OBX+ GEM组:7℃,1%O₂,5% CO₂ ,94% N₂,加入终浓度为10 μmol/L的GEM与终浓度为50 nmol/L的OBX培养24 h与48 h。利用Western blot检测正常氧及低氧条件下MCF-7与BT-20细胞中低氧诱导因子(HIF-1α)的表达;利用CCK-8实验检测各组中MCF-7与BT-20细胞活性,每组设置15个复孔;利用划痕实验检测各组MCF-7与BT-20细胞迁移能力,每组设置6个复孔;利用Western blot检测各组MCF-7细胞中vimentin、E-Cadherin及p53蛋白的表达。结果: HIF-1α在低氧条件下培养的细胞中的表达远远高于其在正常氧条件下培养的细胞中的表达(P＜0.05),说明低氧条件成功;与低氧组相比较,GEM可降低MCF-7与BT-20细胞迁移能力和细胞活性(P＜0.05),减少细胞中vimentin的表达(P＜0.01),促进E-Cadherin和p53的表达(P＜0.01);与GEM组相比较,OBX联合GEM组可明显降低细胞活性和MCF-7与BT-20细胞的迁移能力(P＜0.01),显著降低细胞中vimentin的表达(P＜0.01),显著升高E-Cadherin和p53的表达(P＜0.01)。 结论:在低氧条件下,OBX联合小剂量GEM可显著抑制乳腺癌细胞的生长、迁移、侵袭,增强GEM对乳腺癌细胞的促凋亡作用,具体机制尚需要进一步研究。     

miR-34a-5p靶向GMFB抑制细胞增殖对先天性巨结肠的治疗意义

目的探讨miR-34a-5p通过靶基因GMFB调控神经嵴细胞的增殖。 方法通过荧光定量PCR检测miR-34a-5p在先天性巨结肠症（HSCR）和正常结肠组织中的表达,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-34a-5p的靶基因,SH-SY5Y细胞转染miR-34a-5p mimics及对照miR-NC,并转染GMFB表达载体,通过CCK8检测miR-34a-5p和GMFB对神经嵴细胞增殖的影响,并通过Western Blot检测miR-34a-5p对GMFB蛋白表达的影响。采用t检验和单因素方差分析。 结果荧光定量PCR结果显示,HSCR结肠组中miR-34a-5p的相对表达量为0.43±0.10,低于正常结肠组1.15±0.18,差异具有统计学意义（t = 3.50,P < 0.01）。CCK8结果显示,miR-34a-5p mimics组细胞在培养24?h和48?h后细胞A450值分别为0.53±0.03和0.87±0.04,低于miR-NC对照组0.87±0.03,1.42±0.04。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-34a-5p mimics与GMFB 3'UTR WT载体共转染组荧光强度为0.44±0.03,低于对照miR-NC与WT载体共转染组1.02±0.06。CCK8结果所示,miR-34a-5p mimics+GMFB组细胞培养24?h和48?h后,A450值分别为0.99±0.02和1.50±0.03,高于miR-34a-5p mimics组0.53±0.03, 0.87±0.04,差异具有统计学意义（t?=?7.07,P < 0.01;t?=?9.14,P < 0.01）。Western Blot检测结果显示,miR-34a-5p mimics组细胞的GMFB蛋白表达量为0.25±0.01,低于miR-NC对照组0.90±0.03,差异具有统计学意义（t?=?35.60,P < 0.01）,miR-34a-5p mimics+GMFB组细胞GMFB蛋白表达量为1.03±0.03,高于miR-34a-5p mimics组0.25±0.01,差异具有统计学意义（t?=?42.74,P < 0.01）。 结论miR-34a-5p能够通过抑制靶基因GMFB的表达,抑制神经嵴细胞SH-SY5Y的增殖。