稀有Ju鲫对草鱼出血病病毒敏感性的初步研究

本文报道稀有Ｊｕ鲫对草鱼出血病病毒的敏感性。ＧＣＨＶ是草鱼出血病的病原,用ＧＣＨＶ人工感染１－６月龄的稀有Ｊｕ鲫,在水温２２－３２℃时能导致稀有Ｊｕ鲫出现出血病症状。在水温２８℃时,病鱼在１ｄ内死亡,潜伏期为５ｄ,发病高峰期在感染后第６－８ｄ。ＧＣＨＶ能在稀有Ｊｕ鲫体内传代,并诱导８０％以上的稀有Ｊｕ鲫患病死亡。将人工感染ＧＣＨＶ的稀有Ｊｕ鲫病鱼组织超薄切片,电镜观察,发现在肠道,脾脏,肾脏等组织     

草鱼出血病病毒人工感染稀有Ju鲫出血病鱼主要器官组织的超薄…

用电子显微镜观察了稀有Ｊｕ鲫出血病鱼的病理切片及对照鱼的超薄切片。在对照鱼的鳃、肠道、肾脏、肌肉和肝脏中没有见到任何病毒颗粒。在病鱼鳃血管内皮细胞质中观察到聚集的直径７０ｎｍ左右的ＧＣＨＶ颗粒,说明鳃是ＧＣＨＶ侵袭的主要器官之一,并讨论了鳃对ＧＣＨＶ敏感在ＧＣＨＶ传播的意义。还在病鱼肠道,肾脏中观察到成片的病毒颗粒,它们也是ＧＣＨＶ侵袭的主要组织。在病鱼脾脏在电子密度低在细胞质中观察到散在的病毒可     

草鱼出血病病毒人工感染稀有鼩鲫出血病鱼的组织病理观察

草鱼出血病病毒人工感染稀有鲫出血病病鱼组织病理切片观察,发现肌肉系统血外渗,出现微血栓,红血球浸润于肌纤维之间;鳃小片上皮细胞增生和肥大导致相互融合,血外渗和红血球裂解,形成微血栓和血泡;肠上皮细胞脱落,红血球散布于整个肠壁;肝细胞肥大和细胞实质空泡化,细胞间隙增大;脾组织黄褐色的“小结”增多。而对照鱼未出现上述变化,说明这些病理变化确由ＧＣＨＶ感染所致。     

鱼类培养细胞干扰素的诱导

对紫外线灭活的草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）－Ｆ９株,在几种鲤科鱼类培养细胞中诱导产生干扰素的能力及影响干扰素产量的各因素进行了研究。纯化的ＧＣＨＶ在紫外线照射５分丧失感染性,但获得了在ＣＡＢ等５种鲤科鱼类培养细胞中高铲诱导产生干扰素的能力。干扰素的诱导需要病毒高复数感染细胞。干扰素主要在诱导后１４小时时内产生。培养上清中的新生牛血清对干扰素的产量有抑制作用。而在ＰＨ６．２－７．８范围内对干扰素产量无     

草鱼出血病病毒人工感染稀有(鱼句)鲫出血病鱼主要器官组织的超薄切片观察

用电子显微镜观察了稀有(鱼句)鲫出血病(Hemorrhage of Gobiocypris rarus)鱼的病理切片及对照鱼的超薄切片。在对照鱼的鳃、肠道、肾脏、脾脏、肌肉和肝脏中没有见到任何病毒颗粒。在病鱼鳃血管内皮细胞质中观察到聚集的直径70nm左右的GCHV颗粒,说明鳃是GCHV侵袭的主要器官之一,并讨论了鳃对GCHV敏感在GCHV传播中的意义。还在病鱼肠道,肾脏中观察到成片的病毒颗粒,它们也是GCHV侵袭的主要组织。在病鱼脾脏的电子密度低的细胞质中观察到散在的病毒颗粒。很少见到病毒聚集体,脾脏中的病毒可能是脾脏的吞噬细胞吞噬而来。作者认为在病鱼组织中观察到的大小不同的病毒颗粒是处于不同成熟阶段的GCHV。     

抗草鱼出血病病毒多肽的结构分析

将草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ８７３）颗粒与随机噬菌体九肽库在体外作用,三轮筛选后,从３００个转化的单菌落中获得１６个与病毒高亲和力的噬菌体克隆。接着经过抗病毒试验获得６个能强烈抑制病毒复制的阳性噬菌体克隆,能使病毒ＴＣＩＤ５０下降５个数量级。通过对阳性噬菌体克隆随机插入区域的核苷酸序列分析,推导出多肽的氨基酸序列。发现６个能强烈抑制病毒复制的阳性克隆中多肽的氨基酸序列完全一致（ＮＨ２ＬｅｕＴｒｐＶａｌＧｌｙＧｌｙＧｌｙＡｒｇＡｓｎＡｌａ）,该结果提示多肽的抗病毒能力与多肽特异性氨基酸组成及结构有关。因此,抑制ＧＣＨＶ８７３复制特异性多肽的氨基酸序列的确定及结构分析,不仅为人工合成抗草鱼出血病病毒的多肽奠定了基础,同时也为抗病毒多肽制剂的研制提供了依据。     

草鱼出血病病毒对其它鱼的感染性研究

用草鱼出血病病鱼分离出的草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus,GCHV)感染其它常见鱼并用ELISA方法检查感染鱼组织提取液,结果表明:青鱼、鲢鱼、布氏鳌条对GCHV抗体呈阳性反应;鲤鱼、鳙鱼、鲫鱼、团头鲂、泥鳅则呈阴性反应。综合感染鱼发病症状及死亡特征,初步认为:青鱼对GCHV是易感的,GCHV能在鲢鱼、布氏蟹条体内增值,但毒力较低,鳙鱼、鲫鱼、团头鲂、鲤鱼、泥鳅能抗GCHV感染。     

草鱼出血病病毒多肽的基因定位

用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化的草鱼出血病病毒ＧＣＨＶ８７３的基因组ｄｓ－ＲＮＡ的１１个片段,分别在麦胚无细胞翻译体系中进行翻译。其翻译产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ系统分析。结果表明,基因组片段１、２、３、４、５、和１０分别编码病毒核心衣壳的结构多肽ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ５和ＶＰ１０,片段６和７分别编码病毒外层衣壳的结构多肽ＶＰ６和ＶＰ７。片段８和９分别编码５２ｋＤ和４１ｋＤ的多肽,片段１１编码两种多肽,分子量分别为２９ｋＤ和１９．５ｋＤ,它们与病毒结构多肽无明显对应关系。病毒基因组与多肽大体是一一对应的关系。     

草鱼出血病病原的研究：Ⅱ．电镜观察

在病鱼肾组织中发现有病毒颗粒,在头肾组织中也看到类似的颗粒。病毒呈球形或六角形,直径为60—78毫微米,平均为69毫微米;颗粒中央有一电子密度较高的核心,其直径平均为32毫微米,核心周围包有外膜,宽20毫微米左右。此外,还有一种无外膜的、电子密度均匀的病毒颗粒,直径为46—60毫微米,平均为52毫微米,这种颗粒出现在细胞核和胞质包涵体内。所观察到的病毒颗粒均出现在肾的造血组织内,但红血球和颗粒白血球中没有发现。肾小管上皮细胞正常,也未观察到病毒颗粒。在正常鱼的肾组织中没有发现与病鱼标本中类似的病毒颗粒。因此可以认为,我们人工感染致病的草鱼肾组织中所观察到的病毒颗粒,是草鱼出血病的病原,暂名为草鱼疱疹病毒。     

草鱼出血病病毒多肽的免疫原性

采用中和试验比较了草鱼出血病病毒ＧＣＨＶ８７３的１１个多肽的免疫原性,确定了主要中和抗原。纯化的单个病毒多肽免疫家兔获得抗血清,多太ＶＰ１、ＶＰ５、ＶＰ６和ＶＰ９的抗血清具有中和效价,而ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ８、ＶＰ１０和ＶＰ１１则不能诱生中和抗体。其中ＶＰ５的抗血清中和效价最高,因此,ＶＰ６极可能是病毒多肽中的主要中和抗原。     

三株草鱼出血病病毒免疫原性的比较

从湖南邵阳、湖北仙桃、武汉南湖地区分离到的三株草鱼出血病病毒(GCHV873、GCHV875、GCHV876),分别对家兔进行免疫,并测定了它们在家兔体内形成抗体的水平以及这些抗体对相应抗原的中和能力。实验结果显示:GCHV873产生抗体滴度比GCHV875高一倍,较GCHV876高8倍;其抗体的中和效价分别是1:1778(10~(-3.25))、1:386(10~-(2.59))和1:181(10~-(2.25))。上述结果表明:GCHV873的免疫原性是三个分离株中最强的一个毒株。     

草鱼出血病病毒基因组的cDNA合成、克隆及部分序列分析

采用差速离心的方法纯化感染草鱼出血病病毒的细胞悬液。提纯的病毒粒子经蛋白酶Ｋ处理和酚氯仿抽提,在１％琼脂糖凝胶电泳条件下分离得到１１条ｄｓＲＮＡ,利用柱离心式胶回收试剂盒纯化各基因片段。纯化的ｄｓＲＮＡ溶于９０％的ＤＭＳＯ中,７０℃变性１５ｍｉｎ,然后采用随机引物法反转录合成各基因片段的ｃＤＮＡ,并平头连接于ｐＺＥｒＯ２．０载体的ＥｃｏＲＶ位点,电转化ＴＯＰ１０感受态细胞。重组质粒经酶切、ＰＣＲ扩增得到大小不等的插入片段,ｃＤＮＡＲＮＡ斑点杂交的结果进一步证实其插入为目的基因片段。采用循环ＰＣＲ测序的方法,对其插入片段进行了序列测定,对其中第１１片段的部分序列作了报道。     

草鱼出血病病毒的生长特性及高滴价培养

草鱼出血病病毒感染鱼肾(Clk)单层细胞后,产生明显的细胞病变,其繁殖周期为2—3天。病毒增殖的上升期在感染后的12—48小时。28℃下,当感染复数(Multiplicityof Infection简称MOI)为0.05PFU/cell时,病毒滴价可达1.78×10~(11)PFU/ml,不同温度(25℃、28℃、30℃)下通气培养,测定病毒滴价略有差异。感染病毒的细胞培养液经ELISA检测和电子显微镜观察均为阳性结果,并且能感染健康草鱼。     

从随机噬菌体肽库中筛选抗草鱼出血病病毒多肽的研究

从随机噬菌体九肽表位库中筛选出抑制草鱼出血病病毒（ＧｒａｓＣａｒｐＨｅｍｏｒｈａｇｅＶｉｒｕｓ,ＧＣＨＶ８７３）感染的多肽分子。采用完整、生物素化的草鱼出血病病毒颗粒作为受体,与以融合蛋白形式在丝状噬菌体ｆＵＳＥ５的外壳蛋白Ⅲ的Ｎ端表达的随机九肽库作用。经三轮体外亲和筛选（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）及ＥＬＩＳＡ法检测后,从肽库中筛选出１６个与病毒高亲和力结合的噬菌体克隆,其中六个阳性克隆能有效地抑制病毒在ＣＩＫ细胞中的复制,并使病毒的半数组织培养感染剂量（ＴＣＩＤ５０）下降五个数量级。表明噬菌体肽库技术完全能够应用于抗病毒研究,为研制抗病毒短肽制剂打基础。     

草鱼染色体的包装（间期—中期）

以草鱼ＺＣ７９０１细胞株为材料,观察鱼类细胞从间期染色质到中期染色体的包装过程。主要通过（１）分裂期与间期细胞融合,诱导染色体早熟凝集;（２）染色体“伸长”处理;（３）培养细胞的低渗处理;（４）染色质辅展等方法,制作染色体标本,进行扫描和透射电镜观察。观察表明,鱼类染色质的基本结构与哺乳类细胞相同,也是直径约１０ｎｍ的核丝。染色体的色装有两种形式：一种是多级螺旋化形成直径约３００ｎｍ的染色单体,     

热休克法抑制第一次卵裂实现草鱼雌核发育的细胞学观察

用组织切片方法系统地观察了草鱼卵被经辐射处理的鲤精子激活后进行第一次卵裂的发育过程。实验表明：在24℃孵化水温下草鱼卵在被激活后24min进入第一次卵裂胶期,27－30min处于中期,33min进入后期。由此可知被激活的草鱼卵子在第24min时已经完成染色体的复制,使草鱼卵子雌核染色体人工加倍的最佳时期是在被激活后的27－30min这一时间区段内。此外,用不同热休克温度和不同的热休克强度处理已完成染色体复制的被激活草鱼卵,表明草鱼卵经41℃处理2min可得到较高比例的基因纯合型雌核发育二倍体鱼。     

草鱼早期胚胎表面分化的细胞学研究

本文应用扫描电镜对草鱼的受精卵、2-细胞—囊胚期胚胎细胞的表面分化进行了形态学观察,结果表明,在受精卵卵膜上具有纵多的卵膜孔;受精卵质膜、2-32细胞胚胎质膜上均具有隆起和突起;在2、4、16-细胞期胚胎和囊胚表面发现有小孔结构.本文对某些结构特征进行了讨论.