猪链球菌2型唾液酸合成酶neu B基因敲除突变株的构建及其生物学特性

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33唾液酸合成酶neuB基因敲除突变株。PCR和Southern杂交结果均显示neuB基因在1株转化重组体中完全被壮观霉素抗性基因替代, 表明neuB基因敲除突变体构建成功。生物学特性鉴定显示, 突变体与强毒株在菌落形态、溶血活性以及染色特性方面均无明显差异; 电镜检查发现突变体表面结构组分与强毒株有显著差异, 荚膜明显变薄, 质地更加紧密; 小鼠致病性试验结果显示, 突变体毒力显著减弱。研究结果提示菌体荚膜中的唾液酸对于猪链球菌2型侵袭和致病具有重要作用。     

2型猪链球菌MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33中MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除的突变株,探索SSU0562基因缺失对细菌基本生物学特性和毒力的影响。方法:构建左右两侧为SSU0562基因上下游的同源序列,中间部分为壮观霉素抗性基因(Spcr)的基因敲除质粒,通过同源重组的方法筛选SSU0562基因敲除突变株Δ0562。对突变株与野生株的基本生物学特性进行系统的比较分析,并且将小鼠作为动物感染的模型来研究突变株的毒力。结果:组合PCR的分析及基因测序结果均表明Spcr完全取代了S.suis2中SSU0562基因位点,表明基因敲除突变体Δ0562构建成功,反转录PCR(RT-PCR)证实了突变株Δ0562中SSU0562基因在转录水平的缺失;在溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力方面,突变株Δ0562与野生株05ZYH33相比均无显著差别,然而革兰染色实验显示突变株Δ0562的成链能力明显减弱。结论:猪链球菌强毒株05ZYH33的毒力并未因SSU0562基因的缺失而发生显著性改变,表明SSU0562基因并非猪链球菌的毒力决定因子,但很有可能参与猪链球菌成链能力的调控。     

猪链球菌2型ABC转运蛋白gene0910敲除突变体的构建及活性分析

目的:构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH3389K毒力岛上的ABC转运蛋白gene0910敲除突变体,并初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以猪链球菌2型05ZYH33基因组为模板,扩增gene0910两侧各约500bp左右的片段为上下游同源臂,以pSET1质粒为模板,扩增氯霉素抗性基因Cm为中间片段,采用重叠PCR方法搭建三个片段,并克隆到自杀载体pSET4S上,构建基因敲除的载体。电转化05ZYH33感受态细胞,经30℃双交换和40℃质粒丢失,最后点板法筛选出基因敲除突变体△0910。对突变株和野生株的生物学活性及小鼠的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示gene0910完全被氯霉素抗性基因Cm所替代,基因敲除突变体构建成功。结论:突变株的生物学活性和对小鼠的致病性与野生株相比差异不显著。     

2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33 sao基因敲除突变株的构建及其生物学功能

构建2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)中国强毒株05ZYH33的sao基因敲除突变株。构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为sao编码基因上下游同源序列的基因敲除载体,同源重组筛选sao基因敲除突变株。PCR、RT-PCR、Western Blot对疑似突变株进行验证,实验结果均证实sao基因完全被spc抗性基因替代,成功构建了突变株05ZYH33-sao。对野生型菌株和突变株进行菌落溶血活性、生长特性、小鼠致病性比较,结果表明sao基因的敲除并未使野生型菌株在以上三方面产生明显的变化。筛选获得的05ZYH33 sao基因突变株为进一步研究sao基因在05ZYH33致病过程中的作用奠定了基础。     

猪链球菌2型菌毛骨架蛋白编码基因SSU2101敲除突变株的构建及其生物学功能

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)中国强毒株05ZYH33菌毛骨架蛋白(Backbone protein,BP)编码基因SSU2101敲除突变株。采用引物特异性PCR分析、Southern杂交及RT-PCR等方法鉴定,证实成功构建了BP基因缺失突变株。生物学特性显示,突变株的菌落形态、溶血活性以及染色特性方面与野生株之间均无明显差异。小鼠致病性试验结果显示,突变株的毒力比野生株显著减弱。研究结果提示菌毛在S.suis2感染致病过程中起重要作用,为系统研究S.suis2菌毛分子装配机制及其生物学功能奠定了基础。     

猪链球菌cAMP结合蛋白基因敲除株的构建及生物学特性

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33 c AMP结合蛋白(CRP)编码基因敲除突变株及基因回复互补株,并探究CRP基因的缺失对细菌生物学特性及毒力的影响。方法:构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr)、两侧为CRP编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选CRP编码基因敲除突变株ΔCRP;构建CRP编码基因的互补质粒,通过电转化敲除株ΔCRP,筛选CRP的基因回复互补株CΔCRP;比较分析突变株、野生株和回复互补株的基本生物学特征的差异,并以小鼠作为动物感染模型对突变株、互补株及野生株的毒力进行评估分析。结果:应用组合PCR和基因测序分析,证实构建了CRP的突变株ΔCRP,并筛选出CRP的回复互补株CΔCRP;逆转录PCR证实在突变株ΔCRP中CRP在转录水平缺失,而在回复互补株CΔCRP中其转录回复;在丰富营养情况下,突变株ΔCRP与野生株的溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力均无显著性差异,但突变株的成链能力减弱。结论:CRP编码基因的缺失并未显著改变野毒株05ZYH33的基本生物学特性和毒力,提示CRP可能不是猪链球菌的关键毒力决定因子,其参与碳源代谢等功能有待进一步研究。     

2型猪链球菌SSU0448基因敲除突变株的构建及其毒力分析

【目的】 通过构建2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33的SSU0448基因缺失突变株Δ0448和互补株CΔ0448,探索SSU0448基因缺失对细菌基本生物学特性和细菌毒力的影响。【方法】用同源重组基因敲除方法构建筛选强毒株05ZYH33中N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢途径相关转录调节因子SSU0448基因的缺失突变株,比较分析突变株Δ0448与野生株05ZYH33、互补株CΔ0448的基本生物学特性,小鼠毒力实验分析SSU0448基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】PCR检测分析显示,SSU0448基因在转化重组体中被壮观霉素抗性基因所替代,表明基因敲除突变株构建成功;同时构建了基因功能互补株CΔ0448。生物学特性实验表明突变株Δ0448在成链能力上较野生株明显减弱,对数生长期稍短,快速到达平台期;而菌落形态、革兰氏染色和溶血活性方面无明显差异;小鼠毒力实验发现,突变株毒力并无显著改变。【结论】SSU0448基因的敲除能够改变2型猪链球菌的成链能力;不影响其侵袭致病能力,可能延缓2型猪链球菌的发病过程,此研究为2型猪链球菌致病感染奠定了基础。     

2型猪链球菌gene0969基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33毒力岛89K上的Ⅳ型分泌系统组分gene0969敲除突变体,初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以05ZYH33基因组为模板,PCR扩增gene0969基因的上下游片段;以穿梭质粒pSET1为模板,PCR扩增氯霉素抗性基因Cm;采用重叠PCR方法搭建3个片段,并克隆到自杀载体pSET4s上,构建基因敲除载体,通过同源重组构建gene0969突变体,再用小鼠感染模型对突变株和野生株的毒力进行比较。结果:获得了gene0969基因敲除突变体,并发现其毒力与野生型相比有下降趋势。结论:2型猪链球菌假想毒力因子gene0969可能与毒力有关,其作用和机制值得进一步分析。     

高致病性2型猪链球菌plcR基因敲除株的构建及其相关生物学特性的研究

【目的】构建高致病性2型猪链球菌05ZYH33菌株plcR基因敲除株,通过比较突变株与野生株生物学特性的差异,研究plcR基因在2型猪链球菌致病过程中的作用。【方法】利用同源重组技术敲除plcR基因,多重交叉PCR及RT-PCR鉴定并测序验证。比较野生株与突变株基本生物学特性的差异,小鼠攻毒实验分析plcR基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】经RT-PCR证实05SSU0241与05SSU0242共转录,通过多重交叉PCR及RT-PCR证实成功构建plcR基因缺失突变株,基本生物学特性显示突变株的生长速率、菌落形态、溶血活性均无显著改变,小鼠致病性试验结果显示,野生株攻毒的小鼠死亡率为70%,突变株攻毒的小鼠死亡率为40%,毒力较野生株显著降低。【结论】plcR基因作为2型猪链球菌有毒株基因组中特有的外源基因,在细菌致病过程中具有重要作用。     

Ⅱ型猪链球菌二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体的构建

构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体。构建中间为壮观霉素抗性基因, 两侧为2148hk/rr编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒, 通过同源重组筛选2148hk/rr编码基因敲除突变体。PCR分析和Southern杂交结果均显示2148hk/rr编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代, 基因敲除突变体构建成功。筛选获得05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体, 为阐明该调控系统在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。     

2型猪链球菌菌毛结构亚蛋白tSSU0473的原核表达与免疫学特性研究

目的：探究2型猪链球菌（S.suis2）强毒株05ZYH33的srtF基因簇编码的菌毛结构亚蛋白SSU0473的细菌定位及其免疫保护效能。方法：原核表达截短的SSU0473（tSSU0473）,并以亲和层析法纯化目的蛋白,Western印迹检测tSSU0473蛋白的免疫原性,ELISA法检测多抗血清的效价及IgG亚型,小鼠试验测试重组蛋白的免疫保护效能,免疫电镜观测tSSU0473蛋白的细菌定位。结果：在原核系统中表达了tSSU0473蛋白;ELISA结果显示重组蛋白能够刺激小鼠产生高效价的免疫抗体;动物试验表明tSSU0473蛋白免疫小鼠可抵御致死剂量病原体的攻击,显示出较好的免疫保护作用;免疫电镜检测显示tSSU0473蛋白定位于细菌表面。结论：菌毛亚蛋白tSSU0473是S.suis2膜表面蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性,可作为S.suis2亚单位疫苗的候选分子。研究结果为系统揭示S.suis2的菌毛生物学结构与功能奠定了基础。     

Sialylation of Streptococcus suis serotype 2 is essential for capsule expression but is not responsible for the main capsular epitope

The capsular polysaccharide is a critical virulence factor of the swine and zoonotic pathogen Streptococcus suis serotype 2. The capsule of this bacterium is composed of five different sugars, including terminal sialic acid. To evaluate the role of sialic acid in the pathogenesis of the infection, the neuC gene, encoding for an enzyme essential for sialic acid biosynthesis, was inactivated in a highly virulent S. suis serotype 2 strain. Using transmission electron microscopy, it was shown that inactivation of neuC resulted in loss of expression of the whole capsule. Compared to the parent strain, the ΔneuC mutant strain was more phagocytosed by macrophages and was also severely impaired in virulence in a mouse infection model. Both native and desialylated S. suis serotype 2 purified capsular polysaccharides were recognized by a polyclonal anti-whole cell S. suis serotype 2 serum and a monospecific polyclonal anti-capsule serotype 2 serum. In contrast, only the native capsular polysaccharide was recognized by a monoclonal antibody specific for the sialic acid moiety of the serotype 2 capsule. Together, our results infer that sialylation of S. suis serotype 2 may be essential for capsule expression, but that this sugar is not the main epitope of this serotype.     

粤蓝链霉菌榴菌素生物合成基因orf20的功能

【目的】在大肠杆菌中,转录因子SoxR作为胞内氧化还原感应器,参与抗氧化胁迫的全局性调控。粤蓝链霉菌榴菌素生物合成基因簇内存在一个类soxR基因orf20,但其生理功能仍不清楚。【方法】将orf20基因在大肠杆菌中进行表达,分析携带重组质粒的大肠杆菌对百草枯抗性的变化。同时通过修改后的PCR-targeting方法构建粤蓝链霉菌orf20删除的突变株,分析突变株的表型变化和对百草枯抗性水平的变化。【结果】重组ORF20在羧基端含有组氨酸标签,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,携带重组质粒pET28b-orf20的大肠杆菌对百草枯的抗性水平显著提高。粤蓝链霉菌orf20删除突变株仍具有产孢能力,生长特性没有改变,对百草枯的抗性水平也没有变化,但榴菌素的产量大幅提高,是野生株的3.3倍。【结论】在大肠杆菌中,orf20基因的编码产物能够被百草枯激活,替代SoxR参与抗氧化胁迫的调控。在粤蓝链霉菌中,orf20基因不参与抗氧化胁迫,而对榴菌素的产生有负调控效应。     

Construction and Characterization of a Streptococcus suis Serotype 2 Recombinant Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein

Streptococcus suis serotype 2 (S. suis 2) is an important pathogen, responsible for diverse diseases in swine and humans. To obtain a S. suis 2 strain that can be tracked in vitro and in vivo, we constructed the Egfp-HA9801 recombinant S. suis 2 strain with egfp and spc(r) genes inserted via homologous recombination. To assess the effects of the egfp and spc(r) genes in HA9801, the biochemical characteristics, growth features and virulence in Balb/C mice were compared between the recombinant and the parent HA9801 strain. We detected the EGFP expression from Egfp-HA9801 by epifluorescence microscopy. The results showed that the biochemical characterization and growth features of the Egfp-HA9801 recombinant were highly similar to that of the parent HA9801. We did not find significant differences in lethality (50% lethal dose), morbidity and mortality between the two strains. Furthermore, the bacterial counts in each various tissues of Egfp-HA9801-infected mice displayed similar dynamic compared with the HA9801-infected mice. Our results also showed that the Egfp-HA9801 cells grown at 37°C for 36 h displayed greater green fluorescence signals than the cells grown at 28°C for 36 h and 37°C for 24 h. The fluorescence in the tissue cryosections of Egfp-HA9801-injected mice was also stronger than that of the HA9801 group. Together, these results indicate that the egfp and spc(r) insertions into the Egfp-HA9801 recombinant did not significantly change the virulence when compared with HA980, and this EGFP labeled strain can be used for future S. suis 2 pathogenesis research.     

猪链球菌2型05Z33强毒株转录调控因子Rgg基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg的基因敲除突变体,观察其生物学性状,并在动物感染实验中比较敲除株与野生株的毒力差异,为进一步研究猪链球菌转录调控因子在致病中的作用提供实验基础。方法:分别以猪链球菌2型05ZYH33基因组和pSET1质粒为模板,扩增基因SSU05_1997两侧各约500 bp的片段为上下游同源臂,氯霉素(Cm)抗性基因为中间片段,采用重叠PCR方法连接3个片段;连接产物先克隆到T载体上,再经过酶切克隆到温度敏感自杀载体pSET4S上;将构建的基因敲除载体pSET4S-1997电转化入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度筛选出基因敲除突变体05Z33△rgg;对敲除株和野生株的生物学性状及小鼠和猪的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示基因SSU05_1997完全被Cm抗性基因所替代,基因敲除突变体构建成功;05ZYH33△rgg对小鼠和猪的致病性与野生株相比无明显差异。结论:转录调控因子Rgg可能和猪链球菌2型的毒力无关。     

猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg基因敲除突变体与野生株的基因表达差异分析

目的:为了解猪链球菌2型强毒株05Z33转录调控因子Rgg的调控作用,用基因芯片方法分析野生株与rgg基因敲除突变体之间的差异表达基因。方法:用猪链球菌2型全基因组序列点样制备芯片,将芯片运用于rgg敲除株与野生株的基因表达差异研究,采用定量real-time PCR(qRT-PCR)验证表达谱结果。结果:在突变体中共发现45个基因表达量变化在2倍以上,其中19个基因表达上调,26个基因表达下调。这些基因在细菌毒力、免疫抗原、DNA合成和修复、基础代谢和ABC转运系统等方面起着重要作用。结论:转录调控因子Rgg是一个全局调控因子,但rgg敲除后并不影响猪链球菌的毒力。     

Characterization and functional analysis of atl, a novel gene encoding autolysin in Streptococcus suis

Streptococcus suis serotype 2 (S. suis 2) is an important swine and human pathogen responsible for septicemia and meningitis. A novel gene, designated atl and encoding a major autolysin of S. suis 2 virulent strain HA9801, was identified and characterized in this study. The Atl protein contains 1,025 amino acids with a predicted molecular mass of 113 kDa and has a conserved N-acetylmuramoyl-l-alanine amidase domain. Recombinant Atl was expressed in Escherichia coli, and its bacteriolytic and fibronectin-binding activities were confirmed by zymography and Western affinity blotting. Two bacteriolytic bands were shown in the sodium dodecyl sulfate extracts of HA9801, while both were absent from the atl inactivated mutant. Cell chains of the mutant strain became longer than that of the parental strain. In the autolysis assay, HA9801 decreased to 20% of the initial optical density (OD) value, while the mutant strain had almost no autolytic activity. The biofilm capacity of the atl mutant was reduced ～30% compared to the parental strain. In the zebrafish infection model, the 50% lethal dose of the mutant strain was increased up to 5-fold. Furthermore, the adherence to HEp-2 cells of the atl mutant was 50% less than that of the parental strain. Based on the functional analysis of the recombinant Atl and observed effects of atl inactivation on HA9801, we conclude that Atl is a major autolysin of HA9801. It takes part in cell autolysis, separation of daughter cells, biofilm formation, fibronectin-binding activity, cell adhesion, and pathogenesis of HA9801.