发根农杆菌Ri质粒的分子生物学及其应用前景

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaci-end)均是革兰氏阴性菌,同属根瘤菌科(Rhizobaceae)。根癌农杆菌侵染可以诱使大多数双子叶植物产生冠癌瘤(crown gall),发根农杆菌则可以使植物宿主细胞组织产生毛状根瘤(hairy roots tumors)。土壤杆菌的这一类致病特性早在本世纪初就已被观察     

根癌农杆菌毒力调节基因在识别寄主植物及T-DNA转移的作用

土壤病原菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)通过遗传转化植物细胞,引起许多植物(主要是双子叶)发生冠瘿病。转化实质在于农杆菌DNA中的一个特殊片段,T-DNA从大的(>200Kb)Ti质粒转移到植物细胞核     

亚麻下胚轴转化系统的建立

亚麻是重要的纤维和油料作物,建立简易有效的转化系统,利用农杆菌介导的方法引入有用的外源基因具有十分重要意义。已知不同亚麻品种被根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染的能力差别很大(Zhan XC等 1989)。植物的基因型和农     

发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究

利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导药用植物产生的毛状根具有生长迅速,合成能力强和遗传性稳定等优点,已成为一种新的培养系统。就影响发根农杆菌介导的药用植物遗传转化的因素作一概述。     

农杆菌T—DNA介导的植物转基因的分子机制

前言 根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与发根农根菌(A.rhizogenes)同属根瘤菌科,是革兰氏阴性植物病原菌。前者感染植物引起冠瘿病(Crop gall tumour),冠瘿病用含有抗生素的培养基培养与除菌。可无限增殖;后者感染植物诱发出许多不定根,把不定根培养在上述培养基上也可迅速生长,多次分枝成毛状称毛状根(hairy root)。农杆菌感染机理很复杂。其感染作用起始于受伤的植物细胞分泌的大量化学物质时期。受伤植物细胞分泌的酚分子诱导农杆菌怀有的Ti质粒或Ri质粒上的基因活化,尔后农杆菌紧附植物细胞并把Ti质粒或Ri质粒上一部分DNA(称作T—DNA,tranfer DNA)转移到植物染色体上。T.DNA共价整合后编译合成的新的低分量的代谢物,称为冠瘿碱。     

菜豆根瘤,类根瘤以及根颈瘤的细胞学观察

菜豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv.phaseoli)的共生质粒 pSym 3622转移到具有 C58染色体背景的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中以后,杂交子可以通过伤口感染菜豆(Phaseolus vulgaris)根系,并在接种位点周围诱导类根瘤形成。类根瘤的结构与根瘤和菜豆根颈瘤的结构完全不同,其维管组织位于中央,周围为含有丰富淀粉粒的、高度液泡化的薄壁细胞,而且它的任何细胞以及胞间隙内均不含细菌。但是菜豆有效根瘤则含有大片含菌细胞区,不仅其细胞含有类菌体,而且在胞间隙中也存在细菌。由农杆菌 A208(pTiT37)所诱导的菜豆根颈瘤的任何细胞和胞间隙内也不含细菌。肿瘤的内部结构可以明显地分成许多不同的细胞层次,它们分别起源于不同的分生区;并且其内还可以分化出根伏突起,通过继续发育而形成新根系。此外肿瘤内许多区域的细胞都有明显解体的现象。     

农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立

以南瓜金辉一号(Cucurbita moschata ‘Jinhui 1’)为实验材料, 利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化南瓜子叶节, 研究了预培养时间、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间, 抗生素羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)以及筛选剂卡那霉素(Kan)等因素对离体不定芽的影响, 建立了南瓜最适遗传转化体系。结果表明: 外植体预培养0天,侵染时间30分钟, AS浓度为100 mg·L^–1, 共培养5天可获得最高遗传转化效率; 最适除菌剂为Cef, 其最适浓度为500mg·L^–1; 最适Kan筛选浓度为100 mg·L^–1; 在MS培养基上培养抗性芽生根, 经PCR和Southern blot检测, 证明为转基因植株。     

发根农杆菌诱导玉米毛状根发生及再生植株

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染玉米愈伤组织15天左右获得毛状根. 转化根在不含激素的培养基上快速生长, 并表现出典型的毛状根性状. 在含ZT 1.6 mg/L和NAA 0.4 mg/L的MS培养基上, 毛状根再生成完整转化植株. PCR-Southern杂交证实T-DNA已整合入转化株的染色体组.     

高等植物遗传工程

(二) 细菌根癌病是双子叶植物的一种病害,它是由土壤根癌细菌(Agrobacterium fumefaciens)侵入植株伤口而引起的。根癌细菌是格兰氏阴性菌,具有鞭毛,它与许多迅速生长的根瘤菌,例如苜蓿根瘤菌(R.meliloti)有密切关系;这种根瘤菌在苜蓿根部形成根瘤。根瘤菌寄主范围狭窄;但是,根癌细菌能在许多     

烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探

茄尼醇是合成泛醌类药物的重要中间体。以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)W.T15834感染烟草叶片诱导产生毛状根, 探讨其茄尼醇含量变化。结果显示, 获得的毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长, 但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速, 也不会形成愈伤组织。甘露碱检测及PCR结果证实, 发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在烟草(Nicotiana tabacum)毛状根基因组中整合并得到表达。用改进的HPLC法测定烟草毛状根中的茄尼醇含量, 其结果为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的1.12倍, 但仍比废弃烟叶中茄尼醇含量低43.2％。     

用农杆菌Ri诱导蒙古黄芪发根培养的研究

用蒙古黄芪(Astragalus membranaceus Bunge var mongolicus (Bunge) Hsiao) 无菌籽苗的不同部位作为外植体, 用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) R1601进行感染, 该品系对不同外植体诱导毛状根的能力是不同的。由下胚轴成功的诱导出毛状根。在附加100μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone)、0 3 mg/L IBA的条件下, 诱导率达42 2%。用硅胶薄层层析法检测到毛状根中含有冠瘿碱, 用硅胶薄层扫描法(TLCS) 测定了蒙古黄芪野生根、栽培根及毛状根中的黄芪甲甙( astragaloside IV) 含量, (用黄芪甲甙标准品作对照), 它们分别为0 2654% (DW), 0 2071% (DW) 和0 2535% (DW)。     

桃ACO基因反义转化桃幼胚子叶的研究

用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )和基因枪两种方法,以桃(Prunus persica L. Batsch)幼胚子叶为受体,转化桃ACC氧化酶（ACO）反义基因片段,经筛选培养获得了卡那霉素抗性芽。微芽嫁接培养抗性芽部分可成株。PCR、Southern 杂交和GUS基因表达等分子检测,初步表明外源反义ACO基因已经整合到桃基因组中。     

草酸氧化酶基因转化烟草的研究

为研究草酸氧化酶基因(OxO)对植物抗病的作用,将含有CaMV 35s启动子的植物表达载体以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘方法,转化了烟草97131。具有卡那霉素抗性的再生植株经PCR检测,得到了与阳性对照一致的470bp的片段,进一步对PCR产物测序表明OxO基因已整合进烟草基因组中。在对草酸的耐受性实验中,转基因烟草对草酸的抗性明显高于未转化烟草。     

纤维素降解球毛壳菌NK-102的高效遗传转化方法

摘要:【目的】在球毛壳菌(Chaetomium globosum)NK-102 中,建立菌株特异性转化体系。【方法】构建新的抗性标记pUCATPH-Pgap,转化效率优于pUCATPH 和pCM768。建立了PEG-原生质体和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105 介导的两种转化方法。【结果】原生质体转化效率为30－50 个转化子/10 μg DNA,抗性标记pUCATPH-Pgap 效率最高。EHA105 介导转化率达到3.2×102 转化子/107 孢子。Sout     

农杆菌介导的紫色红曲霉遗传转化体系的建立和优化

通过优化各种转化因素,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导红曲霉(Monascus)的高效转化体系:红曲霉在PDA培养基培养21 d后收集孢子,制备红曲霉孢子悬浮液,浓度为106个/mL,根癌农杆菌浓度为OD600值0.5,诱导剂AS浓度为100μmol/L,农杆菌与红曲霉在25℃共培养3 d。采用此转化体系构建了含有530多个转化子的红曲霉T-DNA插入突变体库。随机选取50株转化子菌株进行分子验证和稳定性检测,证明T-DNA成功插入红曲霉基因组DNA中,并能稳定遗传。最后,通过形态观察筛选出8株变异较大的菌株,为以后的红曲霉基因功能研究奠定了一定的基础。     

根癌农杆菌介导的金边狗牙根遗传转化条件的优化

为建立根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,菌(L.)Pers.]最佳遗传转化体系,以葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的瞬间表达率为指标,从愈伤组织继代时间、根癌农杆菌侵染时间、负压条件及光照时间等方面进行了筛选.结果表明,根癌农杆菌介导的金边狗牙根最佳的转化体系是:以继代培养2周的愈伤组织为起始材料,根癌农杆菌介导感染10 min,经负压处理(抽拉20次)并在全光条件下共培养转化.     

根癌农杆菌转化桥楼及植株再生

用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株C58感染栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）无菌苗诱导冠瘿瘤,获得其冠瘿组织;栝楼冠瘿组织经除菌后能在无激素的MS培养基上良好生长,纸电泳检测结果表明其合成了冠瘿碱,表明Ti质粒转化成功,栝楼冠瘿组织在MS培养基上形成完整植株,移栽后良好生长。     

牧草植物鹰嘴紫云英的遗传转化

鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)是一种优良的豆科牧草。 15kD玉米醇溶蛋白是一种富硫的蛋白质,含硫氨基酸占总氨基酸量的15.63%。本文通过农杆菌(Agrobacterium)的介导将rbcS启动子调控的15kD玉米醇溶蛋白基因的嵌合质粒导入鹰嘴紫云英,得到转化的植株。这些植株具有NPTⅡ酶活性,抗卡那霉素。Southern blot分子杂交表明,15kD玉米醇溶五白基因已转化并整合入鹰嘴紫云英的核基因组中。     

黄华属根瘤茵的16S rDNA-RFLP分析

采用16S rDNA-RFLP及序列分析方法,对分离自黄华属的披针叶黄华、喀什黄华和光叶黄华根瘤菌进行分析研究.结果表明,分离得到的33株根瘤菌在种水平上具有丰富的遗传多样性,它们分别归属于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)和土壤杆菌属(Agrobacterium).其中,以CCNWGS0011和CCNWGS0010-1为代表的5株根瘤菌构成独立的分支,可能为潜在的新种.     

链格孢ATMT转化体系的构建及弱毒突变株验证

本文利用来自质粒pUCATPH的构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子(PtrpC)、终止子(Ttrpc)和潮霉素磷酸转移酶抗性基因(hph)以及植物表达载体pROK Ⅱ成功构建了适用于丝状真菌的根癌农杆菌介导转化的双元载体pROKIIHPH,并转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404,建立了根癌农杆菌LBA4404介导的链格孢Alternaria alternata分生孢子转化体系;再从乙酰丁香酮(AS)浓度、不同的共培养时间、受体菌分生孢子浓度和农杆菌菌液浓度对A.alternata转化效率的影响对体系进行优化.结果确定了根癌农杆菌菌液体积为200 mL(OD_(600)=0.15),A.alternata分生孢子浓度为10~6个/mL,在A.tumefaciens的预培养时期以及与A.alternata共培养时期分别加入200 μmol/LAS,共培养时间48 h,转化率达120～200个/10~5分生孢子.在所筛选的约800个转化子中获得了1株毒性明显低于野生菌sd1的弱毒突变株t108,通过PCR验证推测其毒力降低可能由于T-DNA插入阻断了基因的表达.该实验结果为与突变相关基因的研究以及弱毒株t108的进一步研究和利用提供了实验材料,也为深入研究链格孢sd1菌株的基因功能奠定了基础.