快速、有效筛选新的功能基因——荧光差异显示技术

控制生物性状的基本单位是基因 ,研究细胞的基因表达一直是分子生物学的重要课题之一。不同细胞间基因表达的差异决定了生命活动的多样性 ,如发育与分化、内环境稳定、细胞周期调节等。近年来 ,随着DNA重组技术的发展 ,已有数万个人类基因被克隆分析 ,要从如此众多的表达基因中找出引起细胞生理或病理变化的基因并非易事。应用荧光标记的mRNA差异显示技术将有可能在一定程度上起到关键的作用。以总RNA为模板 ,采用荧光标记的锚定引物 ,通过逆转录、差异显示PCR反应 ,经 5 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带     

差异显示法对血管平滑肌细胞钙化过程中基因表达变化的研究

目的:本研究运用差异显示技术研究动脉血管平滑肌细胞在钙化过程中基因表达的改变,探讨与动脉钙化相关的基因.方法:体外培养牛主动脉平滑肌细胞,在培养环境中加入10 mmol/L的β-磷酸甘油酯,诱导细胞钙化,作为动脉钙化模型,分别提取对照细胞和钙化细胞的总RNA,用荧光标记的引物进行DD-PCR扩增,电泳显示差异表达的cDNA,再用反向Northern blot对这些差异cDNA进行鉴定确认,并对确认的差异cDNA片段进行克隆测序.结果:DD-PCR显示65个表达差异的片段,经过回收、扩增和反向Northern blot有7个片断确定有持续的差异表达.经过测序和同源性比较,发现有3个片段为新的基因片段.结论:初步确定7个与血管钙化相关的cDNA片段,其中3个片段为新的未知基因片段.     

酿酒酵母基因组位置效应对外源基因表达的影响

外源基因元件和模块在底盘细胞中发挥特定功能是合成生物学研究的基本过程,而外源元件和模块在基因组中的位置对其功能的实现具有显著影响。为了系统、全面地表征酿酒酵母基因组位置效应对外源基因的表达影响,以绿色荧光蛋白为报告基因,通过双交换同源重组方法,对酿酒酵母单基因敲除库进行高通量转化,构建酿酒酵母基因组单位点荧光标记菌株库。结合流式细胞术和高通量测序技术对单位点荧光标记库菌株进行分析,构建高表达位点库和低表达位点库,共发现促进绿色荧光蛋白表达的位点428个,抑制绿色荧光蛋白表达的位点444个。通过分析高、低表达位点在酵母染色体上的分布,从全基因组尺度上对酿酒酵母基因组整合位置对基因表达的影响进行表征。本研究可为酿酒酵母基因组位置效应的分布规律和产生机理研究提供重要参考,对外源蛋白工业生产和合成生物学中的基因表达精细调控也具有重要的指导意义。     

对硫磷处理下果蝇细胞应激基因的高通量分析

【目的】通过对硫磷处理黑腹果蝇Drosophila melanogaster(William)的S2细胞,研究果蝇细胞在有机磷杀虫剂作用下应激基因的表达及其表达量的变化。为进一步分析昆虫应激反应及分子毒理提供研究依据。【方法】利用CCK-8试剂盒和细胞计数板检测不同浓度对硫磷处理下细胞的毒性及细胞存活率,应用基因表达谱(RNA-Seq)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测用药处理后细胞内基因的差异表达及表达量的变化。【结果】在35μg/m L对硫磷浓度处理下细胞活力与其他浓度相比呈现一定程度的增强,选用35μg/m L对硫磷处理的细胞做高通量基因表达谱分析显示:35μg/m L对硫磷处理细胞后扩增表达的基因有481个,差异显著表达的基因有52个,包括氧化应激基因、解毒基因和免疫相关基因的扩增或差异表达。q RT-PCR验证基因表达谱中一部分差异显著基因的表达变化与表达谱变化趋势一致。【结论】对基因的差异表达和细胞毒性检测进行了研究,为对硫磷新的作用靶标和抗性机制研究奠定了基础。     

乙型肝炎肝硬化患者外周血单核细胞基因表达谱研究

目的：探索基因表达谱技术在肝硬化形成的分子生物学机制研究及其诊断方法研究的应用。方法：应用含8192个人体cDNA的微阵列芯片和来自外周血单核细胞的标记cDNA,分析慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化各15例基因表达谱。通过CenePix4000B扫描芯片仪和ImaGene3．0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度和比值。结果：在8192个基因中,2组中筛选出有差异的基因60个,占0．73％,其中主要是炎症、凋亡基因、细胞外基质蛋白基因、细胞生长调节基因,占71．6％。结论：基因表达谱技术可为乙型肝炎肝硬化形成的分子生物学机制及其诊断研究提供大量有益的生物学信息。     

糖尿病性高血压大鼠肾损害相关基因cDNA片段的克隆与初步鉴定

为筛选大鼠糖尿病性高血压病所致的肾损害相关基因,自发性高血压大鼠以STZ 50 mg/kg一次性尾静脉注射,建立糖尿病性高血压大鼠模型,4周后该模型大鼠尿蛋白持续阳性,电镜观察到肾小球基质增生、足突融合或扁平.应用荧光标记的差异显示反转录聚合酶链反应(DDRT-PCR)及RNA印迹技术,比较两种模型大鼠肾皮质的基因表达差异,并进行差异条带的cDNA序列生物信息学分析.其中4个差异条带与Genbank数据库比较,2个为未知基因,2个为已知基因,即成淀粉样糖蛋白（amyloidogenic glycoprotein,AGG）、CDK109,两者可能与糖尿病性高血压肾损害的发生相关,对它们的进一步研究将为肾损害发病机理的发现提供思路.     

限制性酶切片段差异显示及其应用

差异显示技术(DD)-PCR是一种研究基因表达差异的重要而应用广泛的方法,传统的差异显示法由于在PCR时采用Poly（T）引物和随机引物而导致较高的假阳性率和产物的近Poly(A)非编码区的大量扩增。改进后的限制性酶切片段差异显示技术(RFDD)-PCR采用ToqI酶切双链cDNA,连上特殊设计的接头,再用经特殊设计的特异性配对于接头的引物来扩增,因此能重点扩增编码区并能极大地消除假阳性率。由于扩增时引物就带有荧光或放射性核素标记,还使得差异显示条带的检测更为方便、灵敏。本简要介绍了该法的原理、步骤、应用及其优缺点。     

用基因芯片结合荧光差异显示—PCR筛选和识别胃腺癌转移相关的基因

使用来源于同一个胃腺癌病人的原发灶RF－1（ATCC编号：CRL－1864）和转移灶RF－48细胞系（ATCC编号,CRL－1863）作为研究肿瘤转移分子机制的模型,RF－1（实验组）和RF－48（对照组）的mRNA通过逆转录方法,将Cy3和Cy5两种荧光染料分别标记到两种细胞的cDNA上,制备成cDNA探针,并与表达谱芯片（双点4096条基因）进行杂交与扫描,重复2次实验,利用计算机数据处理判断基因是否在上述两种细胞中有表达差异,共筛选出差异表达的基因共138条,其中81条在RF－48细胞中表达明显上调,57条在RF－48细胞中表达显著下调,同时也通过荧光差异显示－PCR（FDD－PCR）技术,克服了45个涉及胃腺癌转移相关基因,包括未被发现的基因3个,在两种筛选方法中都存在差异表达的基因共有7条,对部分可能与肿瘤志移机制有关的差异表达基因的作用进行了分析和讨论,基因芯片技术可高通量,大规模地研究基因表达水平,FDD－PCR技术可克隆出未发现的新基因,二者结合,初步筛选出与转移相关的基因,有助于揭示胃腺癌转移的分子机制。     

乙型肝炎肝硬化患者外周血单核细胞基因表达谱研究

目的 :探索基因表达谱技术在肝硬化形成的分子生物学机制研究及其诊断方法研究的应用。方法 :应用含 81 92个人体cDNA的微阵列芯片和来自外周血单核细胞的标记cDNA ,分析慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化各 1 5例基因表达谱。通过GenePix40 0 0B扫描芯片仪和ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度和比值。结果 :在 81 92个基因中 ,2组中筛选出有差异的基因 60个 ,占 0 .73% ,其中主要是炎症、凋亡基因、细胞外基质蛋白基因、细胞生长调节基因 ,占 71 .6%。结论 :基因表达谱技术可为乙型肝炎肝硬化形成的分子生物学机制及其诊断研究提供大量有益的生物学信息     

利用表达谱基因芯片筛选溃疡性结肠炎差异表达基因

目的:利用人类全基因组表达谱芯片技术,分析溃疡性结肠炎患者和健康者基因表达谱差异,筛选出溃疡性结肠炎相关基因。方法:采用Trizol法提取8例溃疡性结肠炎患者和8例健康对照者结肠粘膜组织总RNA并纯化,逆转录合成c DNA,利用荧光染料Cy3标记aa UTP,转录合成标记的c RNA,并与Agilent人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据进行归一化处理,利用倍数差异和t检验计算筛选出相关差异表达基因,采用DAVID在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能,并对部分差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。结果:筛查出溃疡性结肠炎结肠粘膜组织差异表达基因4132个,其中上调基因2004个,下调基因2128个。选取6条差异表达基因进行PCR验证,结果有3条基因表达上调,3条基因表达下调,表达趋势与芯片结果一致。结论:溃疡性结肠炎患者与健康对照者基因表达存在明显差异,分析这些差异表达基因有助于我们探索溃疡性结肠炎的发病机制,为疾病的治疗提供理论依据。     

可用于实时荧光定量PCR标准化的白桦内参基因

为了快速、准确的对白桦多个样品进行基因表达分析,本研究应用荧光定量PCR技术,对白桦持家基因微管蛋白基因（Tu）和泛素基因（UbQ）在不同处理的细胞及不同树龄或不同生长季节白桦植株各部位表达的稳定性进行检测。结果表明,对于茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）处理的白桦细胞和不同生长季节白桦植株的基因定量表达分析,可同时使用Tu和UbQ平衡化qRT-PCR数据;而针对不同树龄白桦茎皮中基因表达研究时,单独使用UbQ基因作为内参对照即可获得精确的表达数据。     

差异表达分析法在细菌致病相关基因研究中的应用

差异表达分析是比较相关细胞特殊表型基因背景的研究方法,应用于致病菌可以研究细菌的致病性、抗药性、遗传特性等。基因差异表达分析主要分四类,其代表性的方法分别为差异显示、消减杂交、基于数据库的基因表达连续分析和DNA微阵列。本文综述此四类方法及其衍生技术的基本策略、应用特点及近年来在细菌致病相关基因研究中的成功应用。     

荧光标记mRNA差异显示技术

目的：应用荧光标记的ｍＢＮＡ差异显示技术。方法：提取未经过／经过ＩＦＮ－ＬＰＳ处理的三组人单核细胞系Ｕ９３７的总ＲＮＡ并以此为模板,采用荧光标记的锚定引物,通过逆转录、差异显示ＰＣＲ反应,经５．６％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带,回收后将其再扩增。结果：三组样本的ＤＤ－ＰＣＲ产物电泳显示长３００ｂｐ￣２．０ｋｂ不等的扩增片段,条带清晰、明亮,背景低,各样本相互间的差异不仅呈有无的变化,亦表现出     

应用基因芯片技术研究原发性腹膜后脂肪肉瘤组织特异性候选基因

目的:原发性腹膜后脂肪肉瘤是一种少见的恶性肿瘤,发病率大约占全部恶性肿瘤的1％,但其却是腹膜后最常见的软组织肿瘤.通过研究原发性腹膜后脂肪肉瘤和正常脂肪组织间的基因表达差异,可以寻找到与原发性腹膜后脂肪肉瘤发生、发展相关的候选基因并为其防治研究提供线索.方法:应用基因芯片技术检测2例原发性腹膜后脂肪肉瘤和相应的正常脂肪组织全基因组序列,分析其基因表达差异.结果:两组间的差异表达基因3828个,其中表达上调有1837个基因,表达下调有1991个基因.其中涉及细胞增殖、黏附、凋亡以及信号通路等多种生物学过程.结论:通过基因表达谱芯片筛选出与原发性腹膜后脂肪肉瘤发生和进展密切相关的基因为其基础研究及临床早期诊断、预防和治疗提供潜在的分子标记和靶基因.     

ZNF230/荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在Cos细胞中的表达与定位

为了用绿色荧光蛋白标记观察人类无精症相关基因ZNF230在Cos7细胞中的蛋白质表达及定位,用PCR方法扩增得到突变的人和小鼠mt ZNF230和mt znf230基因,使其3′端的终止密码TGA突变为TGG,并装入T 载体,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP N1的绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)基因融合,构建了ZNF230—荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入Cos7细胞系。荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP N1转染的Cos细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP ZNF230和pEGFP znf230的Cos细胞中荧光主要聚集在细胞核中。表明转染的Cos细胞系能高效表达人ZNF230和小鼠znf230蛋白,ZNF230基因表达的蛋白定位于细胞核内。     

人间充质干细胞抑制肝癌细胞增殖的作用及其基因表达谱分析

干细胞移植治疗肿瘤具有重要的临床价值．应用人间充质干细胞条件培养液作用H7402肝癌细胞,拟探讨间充质干细胞对肿瘤细胞的抑制作用,为今后应用人间充质干细胞进行肿瘤细胞治疗奠定理论基础．应用胎儿真皮来源的 Z3 间充质干细胞和胎儿骨髓来源的 BMMS-03 间充质干细胞的条件培养液作用于H7402肝癌细胞,采用软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪技术、基因芯片技术和免疫印迹技术观察 H7402 细胞的克隆形成、增殖和基因表达谱变化．结果显示,H7402 细胞在间充质干细胞条件培养液作用下,克隆形成和增殖受到了明显抑制;基因芯片检测结果显示,H7402 细胞在间充质干细胞条件培养液作用下有 23 个基因上调表达,17 个基因下调表达,这些差异表达的基因与细胞的转录调控、新陈代谢、信号转导、细胞周期、应激反应和细胞粘附等功能相关．本实验结果表明,人间充质干细胞对 H7402 肝癌细胞的克隆形成和增殖具有抑制作用,并有多种基因的表达发生改变,这些基因表达的改变可能参与了对上述肿瘤细胞的抑制．     

兔胚胎时期特异性基因相关新片段的克隆

阶段特异性基因的表达是早期胚胎发育过程中的重要事件,对植入前胚胎基因表达模式的研究是进一步研究植入前胚胎发育调控机制的前提。本实验利用mRNA差异显示技术来研究兔(Oryctolagus cuniculus domestica)植入前各期胚胎的基因表达差异。在获得的42个阳性阶段特异性表达的基因中,有5个在NCBI和EMBL数据库中没有同源序列,登录EMBL,申请了登录号。这些新基因片段都是桑葚期特异表达的基因,而且在以后的囊胚期也有表达。兔由母源型调控向合子型调控的过渡是在8～16细胞期开始的,在桑葚期开始表达的这些基因片段应该是兔胚胎时期特异性基因。这些基因的克隆将为进一步研究兔的植入前胚胎发育模式奠定基础。     

干扰小RNA序列非依赖性地影响胰腺癌细胞的基因表达

干扰小RNA(small interference RNA, siRNA)是基因敲减的常用工具,广泛用于基因沉默技术和基因功能研究,在临床疾病治疗等方面也有潜在的应用。一般认为,达到一定长度（比如大于27 bp）的双链RNA可以诱导干扰素反应,降低相关基因的表达。目前,siRNA对基因表达的非特异性作用尚不完全清楚。为研究siRNA干扰的非特异基因表达,本研究以胰腺癌细胞HPAC 和BxPC3 为模型,采用高通量测序技术对6种不同干扰小RNA处理及未作处理的HPAC和BxPC3细胞进行转录组测序分析,筛选出干扰小RNA处理后表达量共同下调的基因进行研究。通过生物信息学方法对表达下调基因的功能进行研究,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对部分下调基因进行验证。结果表明,短片段双链小RNA能够显著改变细胞的基因表达,而这些基因表达谱的变化是有规律的,特定功能的基因优先发生变化。在表达下调的基因中,某些特定类型的基因变化非常显著,包括氨基酸代谢相关基因、Hedgehog信号途径基因和多巴胺受体D5基因等。这些结果表明,在使用siRNA时需要考虑其序列非依赖性地基因表达调控作用。     

基于荧光微球液相基因表达阵列的建立

建立基于荧光微球的液相基因表达阵列,用于特定基因组合的表达谱分析.采用带有不同强度荧光鉴别信号的羧基化微球,与氨基修饰的不同标签寡核苷酸序列化学偶联,制成微球阵列.多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA)用于扩增靶基因核苷酸序列,即通过RNA标本六随机引物逆转成cDNA,与不同基因特异性的一对探针杂交,耐高温的连接酶联接,最后采用生物素标记的同一对引物扩增.PCR产物与微球阵列液相杂交,加入链亲和素标记的PE染料,上流式细胞仪检测.应用这一系统检测骨髓增生异常综合症中难治性贫血(RA)、难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)、难治性贫血伴转化中原始细胞增多(RAEBt)、急性髓细胞性白血病(AML)和其他组(包括再生障碍性贫血、血小板减少、巨幼贫、溶贫等)差异表达谱,差异表达结果用实时荧光定量PCR验证.共建立了5个基因的微球阵列,分别为Rap1GAP、RAC2、SPA1、RhoBTB3和内参GAPDH,每个基因检测的线性范围为0.002 5～0.1μmol,液相表达阵列具有良好的特异性和重复性(P<0.001).检测RA、RAEB、RAEBt、AML和其他组差异表达发现,RAC2、RhoBTB3、SPA-1和Rap1GAP各组间有显著性差异性存在(分别为P<0.000 1,P=0.049 1,P=0.020 6和P=0.004 6),其差异显著性与实时荧光定量PCR一致,泊松相关系数分别为0.930,0.946,0.945和0.921,具显著性(P<0.001).结果表明,成功建立了基于荧光微球的液相基因表达阵列,其敏感性高、特异性强、重复性好.     

基于异源cDNA基因芯片杂交的鳜鱼肌肉组织基因表达谱初步分析

cDNA基因芯片技术已广泛应用于生物物种间功能基因组和表达谱学研究。然而,鱼类基因芯片开发和应用相对落后。为了筛选与肉质性状相关功能基因,本研究首次试用异源斑马鱼基因cDNA芯片,对两种肉质性状明显差异的鳜鱼和鲢鱼肌肉组织中基因表达进行了比较分析。从两种鱼肌肉组织中提取总RNA,经Biotin荧光标记与拥有15617个cDNA片段的斑马鱼基因芯片（Affymetrix）杂交后,检测出375个表达基因。与鲢鱼比较,鳜鱼肌肉组织锁定的基因中有180个上调表达基因和195个下调表达基因。在鳜鱼肌肉组织180个上调基因中,49个为已知功能基因,131个为未知功能基因。根据基因文库同源功能基因分析,我们将49个已知上调基因按功能大约分为七大类,其中与肌肉结构相关基因包括肌球蛋白重链基因（MYH）、肌纤维间连接基因和细胞骨架结构基因等。同时,我们对与肉质结构性状密切相关的功能基因进行了分析,并结合与鳜鱼优良肉质结构和功能基因表达关系进行了讨论。