转基因棉花Bt毒蛋白的表达及其生态学效应

苏云金杆菌毒蛋白 (Bacillusthuringiensisgtoxicprotein)基因导入棉花植株后获得的转Bt棉可以特异性地毒杀棉铃虫及鳞翅目的一些其它害虫 ,有效地保护棉花植株不受此类棉花害虫的危害。Bt毒蛋白在棉花植株中的表达受一些内外界因素的影响而呈明显的时空变化。转Bt棉除了严重影响靶标害虫自身外 ,还能对其它一些非靶标昆虫和环境产生影响。另外 ,该文还对害虫对Bt棉的抗性以及防止害虫产生抗性的治理对策进行了综述     

过表达或沉默棉花GhPCBER基因株系的获得及其茎叶木质素和木脂素含量研究

编码苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)的基因PCBER属于PIP亚家族,是苯丙烷代谢途径中参与木脂素合成的关键基因。该研究构建了棉花GhPCBER基因的植物过表达载体并转化拟南芥,同时构建了VIGS(virus induced gene silencing,病毒诱导的基因沉默)载体转化棉花,采用实时荧光定量PCR技术对GhPCBER基因在不同组织中的表达进行分析;对野生型和转基因植株茎叶组织中的木质素和木脂素含量进行测定分析。结果表明:(1)成功构建了GhPCBER植物过表达载体pGWB17-GhPCBRE以及基因沉默重组载体pTRV2-GhPCBER;经遗传转化获得6株转棉花GhPCBER基因抗性拟南芥植株,同时获得15株GhPCBER基因沉默棉花植株(5株为一组)。(2)PCR检测表明,6株转基因拟南芥均为过表达株系,其中株系1、2、3相对表达量更高,且在茎、叶组织中的表达量分别较野生型提高了7～14倍和6～16倍,表明GhPCBER基因成功在拟南芥中过表达;GhPCBER基因沉默棉花植株的茎、叶组织中的表达量分别比野生型棉株约下降12%和26%,表明烟草脆裂病毒(TRV)体系(pTRV2-GhPCBER)成功抑制了GhPCBER基因的表达。(3)转GhPCBER基因拟南芥茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均显著降低;GhPCBER基因沉默棉花植株茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均极显著降低;组织化学染色观察发现GhPCBER基因沉默棉花植株茎秆颜色明显比野生型染色浅,也证明沉默基因棉花植株茎秆中的木质素含量减少。(4)苯丙烷代谢通路中8个相关基因的实时荧光定量PCR分析发现,过表达或抑制GhPCBRE基因均会导致苯丙烷代谢途径发生重新定向。     

转(Bt Cry1Ac+CP_4EPSPS)基因抗虫抗草甘膦棉花对草甘膦的耐受性研究

本研究比较了转Bt Cry1Ac+CP_4EPSPS基因抗棉铃虫抗草甘膦棉花与常规棉花在新疆棉区对草甘膦的耐受性差异。两年的研究结果表明,转Bt Cry1Ac+CP_4EPSPS基因抗棉铃虫抗草甘膦棉花对草甘膦有较好的耐受性,而对照棉花中棉所49对草甘膦耐受性较差。苗期喷施草甘膦后转基因抗棉铃虫抗草甘膦棉花生长发育没有受到影响,而对照棉花中棉所49喷施草甘膦后生长发育受到了明显的影响,个别植株甚至死亡。转Bt Cry1Ac+CP_4EPSPS基因抗棉铃虫抗草甘膦棉花株高、真叶数、蕾数、产量等指标与对照相比差异显著。转Bt Cry1Ac+CP_4EPSPS基因棉花对草甘膦的耐受程度显著高于非转基因棉花。草甘膦对转基因抗草甘膦棉花无负面影响。     

转天山雪莲冷调节蛋白基因烟草的获得及其抗寒性鉴定

从已建立的天山雪莲cDNA文库中随机挑取单克隆,采用通用引物M13扩增出基因序列并测序,然后将该序列在GenBank中进行比对,根据该序列设计特异引物进行PCR,最终获得了冷调节蛋白基因siCOR的完整开放读码框(ORF);构建植物表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因烟草,用RT-PCR对转化烟草进行鉴定,收取种子后筛选出纯合的T3株系,并通过冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果表明:(1)siCOR大小661bp,与禾本科植物粳稻的冷调节蛋白基因一致性最高(65.04%)。(2)与野生型植株相比,转siCOR基因烟草均叶片浓绿、无分支侧芽,生长快;在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因的烟草叶片相对含水量、PSⅡ相对量子产率降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均低于野生型烟草植株,而且转siCOR基因烟草植株叶片出现萎蔫症状的时间较迟、程度较轻,受到的伤害也较轻。研究发现,在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因烟草植株表现出良好的生理和生长优势,显示出了较强的抗寒特征。     

棉花转基因技术和转基因棉花

概述了棉花转基因育种技术和转基因抗虫棉、转抗除草剂基因棉花、转抗病基因棉花、转品质改良基因棉花及天然彩色棉花等的研究概况。     

转大肠杆菌过氧化氢酶基因棉花的抗旱生理研究

以导入大肠杆菌过氧化氢酶基因KatE的T3代转基因棉花为供试材料,经卡那霉素检测和PCR鉴定,将筛选出的阳性转基因植株与对照棉花进行整个生育期的持续水分胁迫处理直至收获,比较材料间的生理生化指标的差异,鉴定转基因植株的耐旱能力。结果显示:(1)干旱胁迫持续至初蕾期时,转基因棉花与对照植株间各项抗旱生理指标差异均未达到显著水平。(2)水分胁迫持续至盛蕾和盛花期时,转基因棉花叶片相对含水量、光系统Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)、CAT活性,以及叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)均显著或极显著高于对照植株,叶绿素含量也都明显高于对照植株。干旱胁迫持续至吐絮期时,转基因棉花的株高、果枝数和铃数均显著或极显著高于对照植株,且转基因棉花和对照的籽棉产量分别比正常灌溉处理降低57.5%和60.1%,全生育期的水分胁迫严重影响了棉花籽棉产量,但转基因棉花的籽棉产量仍显著高于对照。研究表明,在新疆石河子当地自然降水(干旱胁迫)条件下,转KatE基因棉花表现出了较好的生理和生长优势,KatE基因有助于提高棉花的抗旱性。     

人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究

根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因sNK和其中插入番茄果实特异表达基因E8第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i,通过农杆菌侵染的方法转化到烟草NC89中。经PCR检测,得到12株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株,初步证明目的基因已整合到烟草基因组中;RT-PCR检测有9株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株为阳性;通过RT-qPCR将两种基因在烟草中的表达量进行比较,结果表明转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因的植株中高;通过纤维蛋白平板法检测其活性,共有5株转sNK基因烟草植株和3株转sNK-E8i基因烟草植株检测到溶圈,说明目的基因在部分转基因烟草中可正常转录和翻译并表现出溶栓活性。经加代培养已得到T1代转基因植株。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因在棉纤维中的表达及对其结构组分的影响

利用农杆菌介导法获得‘新陆早36号’转棉花肉桂醇脱氢酶基因(GhCAD6)材料,以转基因T₆代植株为试材,对GhCAD6基因在叶片基因组中的整合情况和不同发育阶段棉花纤维中的表达量进行分析,研究该基因对棉纤维中结构多糖和苯丙烷类化合物含量及纤维中苯丙烷类结构单体的影响。结果显示：(1)GhCAD6基因以单拷贝的形式整合到受体棉花基因组中。(2)转基因植株纤维中GhCAD6基因的表达量低于相同发育阶段对照样品,在对照样品中GhCAD6基因的表达量表现为先升高,在20 DPA(开花后天数)时表达量最高,之后下降,而在转基因植株纤维中先上升,并于发育15 DPA时表达量下降,20 DPA时又上升至最高,之后再次下降。(3)成熟纤维中,转GhCAD6基因植株纤维中苯丙烷类化合物含量低于对照,但结构多糖含量的差别不明显。(4)转GhCAD6基因纤维中苯丙烷类结构单体——紫丁香基木质素(S 木质素)和愈疮木基木质素(G 木质素)的比值下降。研究表明,棉花转入GhCAD6基因后,纤维发育(15 DPA)中GhCAD6基因的表达量变化可能导致棉花中苯丙烷类化合物含量及其结构单体比率变化,从而造成棉花纤维品质改变。该研究结果可为深入分析GhCAD6基因在改良棉花纤维品质的作用机理提供理论依据。     

甘蓝型油菜Fad2基因的RNA干扰及无筛选标记高油酸含量转基因油菜新种质的获得

利用已获得的油莱种子贮存蛋白——十字花科蛋白（cruciferin）基因的启动子和终止子,构建了无选择标记基因且同时具有正义及反义结构的油酰去饱和酶基因（Fad2）种子特异表达RNAi载体,并通过农杆菌介导的转化,获得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表达受抑制的转基因植株。RT—PCR分析结果表明,在油酸含量达到83.9％的转基因植株中未检测到在非转基因植株中普遍存在的Fad2基因转录mRNA——一种典型的RNA干扰现象。通过对植株生长发育状态的观察比较,该高油酸含量转基因株系并未表现出双突变体中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、发育迟缓、花蕾死亡、结实率低等不利农艺学性状。     

菊花转抗虫基因植株的PCR快速鉴定

华中农业大学园艺与林学学院蒋细旺和包满球教授用PCR法快速鉴定了菊花转抗虫基因植株。他们对经过卡那霉素抗性筛选所得的菊花转苏云金芽孢杆菌蛋白Bt基因和转雪花莲外源凝集素GNA基因所得的抗性植株,利用改良SDS法提取菊花DNA,然后利用NPTII引物对6个菊花品种的抗性植株所得出的DNA进行PCR扩增,发现了符合NPTII基因片段大小的亮带,初步证实获得了转Bt基因和转GNA基因的菊花植株。