毕赤酵母外源蛋白分泌途径的研究进展

毕赤酵母作为一种重要的表达外源蛋白的宿主,提高其外源蛋白的分泌量非常有必要。近年来很多学者报道了与毕赤酵母外源蛋白分泌相关的基因、蛋白质,同时毕赤酵母基因组的公布加快了这方面的研究进展。文章根据外源蛋白分泌的途径,分步骤地总结了涉及的基因和蛋白,有利于分析控制蛋白分泌效率的具体步骤,为构建更加高效的毕赤酵母表达系统提供参考。     

改良毕赤酵母分泌表达外源蛋白能力的研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)由于能高效表达正确折叠加工的外源蛋白而成为目前最具应用前景的表达宿主.但随着对大量不同外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究发现,并不是所有蛋白均能高效分泌表达,这严重限制了毕赤酵母这一表达系统的推广应用.相关研究发现,外源蛋白在内质网中的聚集是限制酵母分泌表达外源蛋白的主要因素,因此近年来开始尝试通过基因操作改良毕赤酵母表达外源蛋白的能 力.本文综述了这一领域的研究进展.     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统现在已经发展成为一种高效的外源蛋白基因优秀表达系统,该系统具有高表达、高稳定、高分泌、容易放大和成本低等优点,目前已有多种外源蛋白基因在该系统中实现高效表达,对巴斯德毕赤酵母表达系统的进一步研究将会促进其大规模的工业化应用。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

毕赤酵母表达系统优化策略概述

毕赤酵母(Pichia pastor)表达系统是近年发展起来的一种高效表达外源蛋白的系统,利用该系统表达外源基因具有良好的应用前景。尽管毕赤酵母表达系统具有比较完备的基因表达调控机制和对真核基因表达产物的加工修饰能力,但由于基因本身及表达系统等诸多因素,仍然存在外源蛋白表达产量很低甚至不表达的情况。针对毕赤酵母表达系统这一因素,对表达载体的优化,毕赤酵母菌株优化及发酵条件优化进行了综述,以期为外源基因在毕赤酵母中的高效表达提供理论基础。     

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统 ,与现有的其它表达系统相比 ,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时 ,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的 pH值等诸多因素的影响 ,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低 ,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析 ,结合具体实践经验 ,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。     

毕赤酵母高效表达策略概述

毕赤酵母表达系统是外源蛋白表达的较为理想的系统,但是并不是所有蛋白都能利用此系统获得高效表达,不同来源的蛋白,其表达水平、生物活性和稳定性均存有明显差别。概述了影响毕赤酵母高效表达的主要因素以及外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略。     

毕赤酵母优化表达外源蛋白策略

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种异源蛋白表达的理想系统,但目前并非所有的外源蛋白都能在毕赤酵母中成功高效表达,不同的蛋白表现为不同表达水平、生物活性及稳定性。从遗传因素和表达条件综述了外源蛋白在毕赤酵母中的优化表达策略。     

基于毕赤酵母系统表达的重组自身免疫调节生物制剂的研究进展

免疫调节制剂的靶目标为免疫系统相关分子如细胞因子、共刺激分子等,在治疗自身免疫病中很有潜力。免疫调节制剂的生产需要合适的表达系统,而毕赤酵母系统具有便于基因操作、易培养和高密度发酵等特征;更重要的是,毕赤酵母为真核细胞,可进行翻译后修饰并分泌可溶性的正确折叠的重组蛋白,其生物活性及功能也得到相应提高,这些优势使得毕赤酵母成为高效实用的蛋白表达宿主。我们就毕赤酵母系统表达的用于治疗自身免疫病的几种免疫调节制剂的研究进展做简要综述。     

毕赤酵母液滴微流控高通量筛选方法的建立与应用

巴斯德毕赤酵母是当前应用最为方便和广泛的外源蛋白表达系统之一,为了进一步提高其表达外源蛋白的能力,文中建立了基于液滴微流控的毕赤酵母高通量筛选方法,并以木聚糖酶融合荧光蛋白为例,筛选获得木聚糖酶表达和分泌能力提高的突变株。通过PCR扩增得到木聚糖酶xyn5基因和绿色荧光蛋白gfp基因融合片段,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建出木聚糖酶融合绿色荧光蛋白的质粒pPIC9K-xyn5-gfp,电转化至毕赤酵母GS115中得到表达木聚糖酶和绿色荧光蛋白的毕赤酵母SG菌株。该菌株经过常压室温等离子体诱变后进行单细胞液滴包埋,液滴培养24h后进行微流控筛选,获得高表达木聚糖酶的突变菌株,进而用于下一轮的诱变突变库构建和筛选。以此类推,经过5轮液滴微流控筛选,获得一株高产菌株SG-m5,其木聚糖酶活为149.17U/mg,较出发菌株提升300%,分泌外源蛋白的能力较出发菌株提高160%。文中建立的毕赤酵母单细胞液滴微流控高通量筛选方法能达到每小时10万菌株的筛选通量,筛选百万级别的菌株库仅需10h,消耗荧光试剂体积100μL,对比传统的微孔板筛选方法降低试剂成本近百万倍,为高效、低成本筛选获得表达和分泌外源蛋白能力提高的毕赤酵母提供了一条新途径。     

巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展

巴斯德毕赤酵母是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统。分别从的菌株、载体、外源基因整合、表达产物糖基化和外源基因高效表达等方面综述了毕赤酵母表达系统的研究进展。     

猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达

密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕赤酵母低利用密码子突变为其高利用率的简并密码子。结果表明,替换野生型E2基因上24个酵母低利用密码子后,E2基因在酵母中表达水平有较显著提高,表明通过密码子优化提高E2基因在毕赤酵母中的表达这一策略是成功的。     

外源基因在毕赤酵母中表达的优化

巴斯德毕赤酵母是近年来成功的外源基因表达系统,已表达出众多外源蛋白。它既能像原核生物一样快速生长高密度发酵,又能进行真核翻译后修饰,并且蛋白分泌量大,因此应用越来越广泛。如果对它的表达载体,转化诱导条件和目的基因内部结构,发酵条件等方面进行优化,能够进一步发挥它的优势,更好地表达需要的外源蛋白。本文就毕赤酵母表达系统表达优化进行总结综述。     

影响外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达和分泌的研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的外源蛋白表达系统.但外源基因在该系统中表达时,由于受自身特性及环境等诸多因素的影响,在表达过程中出现表达量不够稳定或较低,甚至不表达的情况.本文对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析,并就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了简要的综述.     

影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素

要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量,必须要较为全面地了解影响其表达的许多因素。影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括：外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。本文就这些因素进行分析,并提出一定的对策和建议。     

巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望

巴斯德毕赤酵母经过近二十来年的发展,已经成为表达外源基因的优秀表达系统之一,成功地表达了许多重组异源蛋白。从表达菌株,表达载体等方面详细综述了毕赤酵母表达系统的优点,如：营养要求低、可高密度发酵、遗传稳定性高等;分析了可能影响巴斯德毕赤酵母表达系统的相关因素,这些因素包括外源基因的特性、基因拷贝数、产物稳定性及发酵策略等,结合这些因素和具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量进行了阐述;讨论了该表达系统存在的不足之处并且展望了其发展前景。     

外源基因在巴斯德毕赤酵母中多拷贝整合的研究进展

巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)以其独特的生物学和遗传学特征已成功地表达了各种类型的外源蛋白。本文综述了巴斯德毕赤酵母的一些特征和优势,及其产生外源基因多拷贝的原理。了解如何通过多拷贝整合外源基因在巴斯德毕赤酵母中提高外源蛋白表达量、基因拷贝数与表达量的关系,以及如何定量和半定量鉴定拷贝数等,在理论研究和实践应用中,特别是在生物制药工业中具有重要意义.     

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展

毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效表达外源基因的表达系统。综述了毕赤酵母表达系统的起源、生物学特性、融合蛋白的表达以及影响蛋白表达量的因素。     

重组毕赤酵母甲醇利用表型与基因拷贝数对外源基因表达的影响

毕赤酵母是目前最优秀的外源蛋白表达系统之一。本文着重对重组毕赤酵母甲醇利用表型（Mut+型、MutS型和Mut-型）、基因剂量对外源蛋白高效表达的影响机理进行综述。MutS型的比生长速率和蛋白产率比Mut+型低、发酵周期长、副产物（如乙醇、乙酸等）形成速率不同。外源基因拷贝数对外源蛋白的影响主要有三种情况：（1）高基因拷贝数对外源蛋白表达水平有明显的正效应作用;（2）基因拷贝数增加反而降低了表达水平,即负效应作用;（3）重组蛋白表达与基因剂正相关,之后则表现负相关关系,这可能与外源蛋白翻译后加工有关（如二硫键形成、折叠等）,而与分子伴侣共表达可促进外源蛋白的高表达。     

分子伴侣对可溶性肿瘤坏死因子相关促凋亡配体在巴斯德毕赤酵母中表达的影响

目的:提高外源蛋白可溶性肿瘤坏死因子相关促凋亡配体(sTRAIL)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。方法:根据GenBank公共数据库中公布的模式生物酿酒酵母的分子伴侣(Ssa1p、YDJ1、Kar2p和PDI)基因序列设计引物,利用PCR方法从酿酒酵母基因组中得到各基因片段,并将单独Ssa1p或Kar2p、组合YDJ1 PDI、Kar2p PDI或YDJ1 PDI PDI分别构建到pPIB2Z表达载体中,并整合到外源蛋白sTRAIL工程菌(毕赤酵母GS115)中进行筛选和诱导表达。结果:SDS-PAGE分析表明,sTRAIL的表达量明显提高,特别是整合了分子伴侣组合YDJ1 PDI的工程菌。Western印迹分析整合的分子伴侣基因后,分子伴侣蛋白在工程菌中的表达量得到了提高。结论:提高细胞内分子伴侣的表达,可以增加外源蛋白的分泌表达,为进一步研究巴斯德毕赤酵母奠定了基础。