LytSR和PdtaSR双组分系统对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的影响

【目的】须糖多孢菌(Saccharopolysporapogona)基因组中存在一些双组分系统(two-component system,TCS),包括一个LytR调控因子和一个PdtaR转录抗终止调节因子,我们旨在通过基因工程技术改造分析这两个双组分系统蛋白在须糖多孢菌中的作用。【方法】本研究利用融合PCR和属间接合转移技术,构建了S. pogona-?lytR和S. pogona-PdtaR工程菌株,研究它们对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的影响。【结果】HPLC检测和质谱鉴定表明,与原始菌相比,S. pogona-?lytR中丁烯基多杀菌素产量有所提高,而S. pogona-PdtaR中产量下调,表明lytR和pdtaR对丁烯基多杀菌素生物合成有负调控作用。此外,生长曲线测定和表型分析结果表明,S. pogona-?lytR和S. pogona-PdtaR对须糖多孢菌的生长发育和孢子形成也产生了一定的影响。【结论】本研究为进一步阐明丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制奠定了理论基础。     

fcl基因对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及生长发育的影响

fcl基因编码的GDP-岩藻糖合成酶(GDP fucose synthetase,GFS),能催化由GDP-D-甘露糖合成GDP-L-岩藻糖过程中的两步差向异构酶和还原酶反应;还参与氨基糖和核糖的生物合成,是调控生物体糖代谢、核苷酸代谢的关键酶之一。通过前期基因组测序表明须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona中存在fcl基因。利用基因工程技术构建了fcl基因的过表达菌株S. pogona-fcl和敲除菌株S. pogona-Δfcl。结果表明该基因对菌株生长发育、蛋白表达及其转录水平、杀虫活性、丁烯基多杀菌素的生物合成均存在影响。经HPLC分析显示,S. pogona-Δfcl的丁烯基多杀菌素产量增加为野生型菌株的130%,S.pogona-fcl的丁烯基多杀菌素产量降低了25%。生测结果显示,与野生型菌株相比S.pogona-Δfcl对棉铃虫的杀虫活性明显增强,而S.pogona-fcl的杀虫活性降低。利用扫描电镜观察发现,S. pogona-Δfcl菌丝体表面出现褶皱,呈现短棒状,S. pogona-fcl菌丝形态与野生型菌株一致。以上结果表明,fcl基因的敲除影响菌丝体的生长发育,能促进丁烯基多杀菌素的生物合成和增强杀虫活性,该基因的过表达抑制了丁烯基多杀菌素的生物合成和降低了杀虫活性。SDS-PAGE结果表明,三株菌株在96 h时蛋白表达差异最为明显。对差异蛋白通过实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,三菌株蛋白的转录水平存在显著表达差异。通过研究结果构建了网络代谢调控图,分析fcl基因对须糖多孢菌生长发育及丁烯基多杀菌素生物合成代谢调控网络途径的影响,初步构建了fcl基因调控的代谢途径,为揭示丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制及相关后续研究提供了实验依据。     

须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的核糖体工程改造对丁烯基多杀菌素合成的影响

核糖体工程是以微生物的各类抗生素抗性突变为筛选标记,高效获得次生代谢产物合成能力提高的突变株的一种育种新方法。通过核糖体工程技术,使用链霉素对须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona进行抗性选育,以获得高产丁烯基多杀菌素突变菌株。对原始菌株和所获得的突变菌株代谢产物的研究发现,相对于原始菌株,其中突变株S13的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高了1.79倍。经质谱测定表明,其代谢物中比原始菌株多了一种丁烯基多杀菌素组分Spinosynα1。对抗性突变株S13的DNA序列进行分析,发现在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中出现点突变,第314位和第320位的胞嘧啶(C)分别突变为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T),对应的氨基酸残基分别由脯氨酸突变为谷氨酰胺,丙氨酸突变为缬氨酸。研究显示,突变株S13遗传稳定性良好。     

金霉菌的生理和金霉素的生产 金霉菌对醣类的生物氧化和金霉素综合的研究

在研究金黴菌对醣类的氧化和金黴素的生产中,我们的工作指出磷酸盐起着一个很显著的影响。发酵培养基中磷酸盐浓度的增加,一般促进了菌体对醣类的氧化从而影响到菌体的生长和金黴素的产量,关於金黴菌对醣类的氧化代谢方面,我们初步研究的结果希望能够提供封金黴菌利用碳源进行发酵时的一点理论基础。一.菌体对醣类的利用以金黴菌 Streptomyces aureofaciens A 3菌株为试验材料,以有机发酵培养基进行试验,结果指出这个菌株能利用蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖和澱粉进行发酵,但不能利用麦芽糖、乳糖、甘露糖及山梨糖。在这几种可以被利用为碳源的醣类中,葡萄糖要算是最适合於对金黴素生产用的碳源,而澱粉是较适合於菌体生长用的碳源。但对金黴素生产上最适宜的碳源並     

深黄被孢霉利用不同碳源产油脂比较

本研究主要探讨深黄被孢霉M2菌株对生物质全糖的利用,考察其碳源同化能力、不同碳源下产脂情况以及对玉米皮渣的利用能力。研究结果表明,M2菌株能够利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖进行生长和油脂积累。M2菌株以6%糖浓度的玉米皮渣水解液为底物发酵培养,油脂微生物生物量达18.2g/L,干菌体油脂含量45.7%,单位体积发酵液油脂产量为8.3g/L。     

碳源影响水稻根际假单胞菌PA1201藤黄绿菌素的生物合成

【背景】假单胞菌PA1201是一株水稻根际促生菌,其产生的次生代谢物藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)能够有效抑制多种植物病原真菌和细菌的生长,但在常规培养条件下Plt产量极低。【目的】研究碳源对Plt生物合成的影响,为提高Plt的产量以及应用提供理论基础。【方法】将基本培养基(minimal medium,MM)中甘露醇替换为不同的碳源及碳源组合作为PA1201的培养基,生长过程中不同时间点取样提取Plt,利用高效液相色谱(HPLC)法分析Plt的产量变化。【结果】建立了基于HPLC定性和定量检测Plt的方法;比较了PA1201菌株在不同培养基中菌株生长和Plt的产量,发现果糖和甘露醇促进Plt生物合成;果糖和甘露醇对Plt生物合成没有增效作用;在含有甘露醇或果糖作为唯一碳源的培养基中,添加葡萄糖或琥珀酸抑制Plt生物合成。【结论】果糖和甘露醇促进水稻根际假单胞菌PA1201合成藤黄绿菌素,这为提高藤黄绿菌素的生物合成效率和促进藤黄绿菌素的应用奠定了基础。     

提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条件的优化

为了进一步提高极细链格孢菌产蛋白激发子的产量,通过单因子和多因子试验与分析,筛选优化了适于极细链格孢菌产生蛋白激发子的培养基和培养条件,并检测了发酵过程中pH、还原糖、氨基氮和菌丝量变化以及与蛋白激发子产量的关系。结果表明,土豆淀粉和黄豆粉对蛋白激发子产量影响最大,其次是蛋白胨和无机盐。优化的发酵培养基主要成分（g／L）：碳源I 15、葡萄糖5、玉米淀粉5、土豆淀粉20、谷氨酸10、氮源I5、黄豆粉10、硫酸铵5。确定了优化的培养条件,调整培养基起始pH为7．0～7．5,将18h菌龄的种子培养液按10％接种量接种到装液量为75mL的500mL摇瓶中,在温度（28±1）℃、摇床转速180r／min下培养可获得理想的蛋白产量。在优化的培养基和培养条件下,发酵12～48h该菌进入对数生长期,48h进入稳定生长期,60h菌丝扣蛋白激发子产量达最高。蛋白产量与菌体生物量呈正相关,当还原糖、总糖量消耗到最低水平时,菌丝产量和蛋白激发子产量达最高。优化的培养基菌丝干重收率迭3．9g／100mL,蛋白激发子产量达到5．17g／L,比普通的土豆液体培养基提高近4倍。     

假蜜环菌液体深层发酵条件的研究

对该真菌菌丝体的液体深层培养条件进行了探讨为进一步工业化发酵提供参考数据。方法：在基本培养基的基础上分别改变碳源、氮源、无机元素和C／N比对该菌的液体深层发酵情况,包括测量各培养条件下耗糖情况、绘制生长曲线,观察菌体的生长形态等等。结果：假蜜环菌的菌丝产量在第6d可达到最大值,其后会逐渐降低,并伴有溶菌的现象发生。在培养初期加入微量钴元素有利于刺激糖代谢提高菌体对糖的利用率,其作用主要是缩短延滞期。进入指数生长期后连续补加碳源有利于菌体迅速生长。优化后培养基组成为：葡萄糖l％和蔗糖1％为碳源,以酵母浸膏l％为氮源,KH2PO4 0．1％,MgSO4 0．05％Z,元素钴适量。液体深层发酵培养6d后菌丝生长状态已达到最佳,在此条件下搅拌发酵培养可收获20mg/ml(干重)的菌丝体。     

一株厌氧嗜热杆菌生长及发酵特性的初步研究

论文对筛选并鉴定为Thermoanaerobacterium saccharolyticum菌株的生长、底物利用情况、产物生成以及酒精耐受性进行了研究。结果表明,该菌在以甘露糖、葡萄糖和木糖为碳源时生长较好,同时能够较好的利用木聚糖和木薯淀粉;最适底物浓度为15g/L;不同的葡萄糖:木糖比例对其生长无显著影响;能耐受的培养基最高初始酒精浓度为3%(V/V)。在5g/L的木聚糖、木糖和木薯淀粉培养基中发酵60h后,产物主要有乙醇、乳酸和乙酸,乙醇产量分别为0.824、0.867和0.916g/L。     

竹黄菌液体发酵条件的优化

目的：筛选并优化竹黄菌液体发酵培养基。方法：采用单因子和3因素3水平正交试验法,从生物量和竹红菌素两方面筛选碳源、氮源和pH,探讨该菌生长的最佳培养条件。结果：最佳发酵碳源是葡萄糖,最佳发酵氮源是硝酸钠。竹红菌素生长的最佳配方为2%葡萄糖,0.2%硝酸钠,pH7.5;菌丝体生长的最佳组合为2%葡萄糖,0.3%硝酸钠,pH7.5。     

三种组成型启动子调控的鼠李糖脂基因在防御假单胞菌中的异源表达及活性研究

本研究利用Red/ETDNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子,成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达,通过LB培养基发酵42h后,Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17.56mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11.135mg/L,441.135mg/L,557.764mg/L,启动子优化后产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量,发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhlAB基因表达量分别是原始启动子的2.16和2.77倍。本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高,可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考。     

斑马鱼热耐受性对温度驯化的响应及其性别差异

为了探究斑马鱼(Danio rerio)热耐受性对温度驯化的响应及其性别差异,将性成熟斑马鱼分别于适温(28℃)、低温(20℃)和高温(34℃)下驯化14 d,之后测定不同温度驯化下雌鱼和雄鱼的临界高温(critical thermal maxima,CTmax)、致死高温(lethal thermal maxima,LTmax)、临界低温(critical thermal minima,CTmin)、致死低温(lethal thermal minima,LTmin)等热耐受性参数.结果表明:驯化温度对雄鱼和雌鱼的所有热忍耐参数(CTmax、LTmax、CTmin和LTmin)均影响显著(P<0.05),并且驯化温度和性别对热耐受性参数的影响具有交互作用(P<0.05).适温(28℃)驯化下,雌鱼与雄鱼各个热忍耐参数相比无显著差异(P> 0.05);低温(20℃)驯化下雌鱼的耐高温能力强于雄鱼,而高温(34℃)驯化下雌鱼的耐低温能力弱于雄鱼.结果提示:繁殖适温下雌雄斑马鱼的热耐受性趋于一致,而非繁殖适温下二者的热耐受性出现分化.     

用于细胞水平家蚕转录调控元件研究的简单基础启动子的构建

【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的能在家蚕细胞中稳定表达且基本不含上游转录调控元件的BmVgP78M启动子的基础上,通过PCR技术在其上游添加一定长度的间隔序列和能够应答20-羟基蜕皮激素(20E)且增强启动子活性的BrC-Z2转录因子结合基序(BrC-Z2 element, BrC-Z2E);通过基因克隆技术构建细胞转染载体;通过细胞转染技术和双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性的变化。【结果】通过在BmVgP78M启动子上游添加28 bp间隔序列,成功构建了一个简单基础启动子,命名为VgP78ML,并证明其为可用于研究目标转录调控元件的简单基础启动子。经实验验证表明,该简单基础启动子不仅可以在家蚕细胞中稳定表达,且其本身活性不受20E及转录因子BrC-Z2的影响;当该启动子上游连接BrC-Z2E时,可以显著地应答20E及BrC-Z2转录因子,从而调控报告基因的表达。【结论】VgP78ML能够作为简单基础启动子应用于细胞水平对家蚕基因转录调控进行研究。同时,其构建方法也为其他物种构建研究转录调控的简单基础启动子提供了参考。     

极端高温和持续中等高温对小菜蛾耐热性的影响

气候变化频率的增加和持续时间的延长,导致具有较短生活史的大部分农业害虫的某一个或某几个生命阶段都可经历热浪的胁迫。热浪对小型昆虫的生态学效应取决于不同生命阶段的耐热性,因而解析特定龄期下昆虫生命阶段的耐热性对理解气候变暖热浪频发的生态学影响具有重要意义。本研究以世界重要蔬菜害虫小菜蛾为研究对象,试验了小菜蛾4龄幼虫、成虫的基底耐热性和诱导耐热性,以及1龄幼虫和3龄幼虫置于不同高温[(31±1)、33±1)、35±1)℃]和暴露时间(3、6、9、12d)组合的持续中等高温耐热性。试验发现幼虫和成虫具有不同的基底和诱导耐热性,具有较弱基底耐热性的幼虫反而具有更强的诱导耐热性。不同生命阶段在持续数天的中等高温胁迫下具有不同的存活表现,早期生命阶段存活率较后期阶段的低,而且这种差异在较强高温下表现得尤为明显。昆虫不同阶段耐热性的差异,对种群的维持具有重要的生态学意义。大多数农业害虫田间种群具有混合年龄结构,热浪后耐热的发育阶段的存活,保证种群可以一直生存和繁衍下去。     

红颈常室茧蜂蛹发育的形态特征

红颈常室茧蜂Peristenus spretus Chen et van Achterberg是一种绿盲蝽若虫的优势内寄生蜂,本研究利用超景深三维显微系统、显微镜观察了红颈常室茧蜂老熟幼虫发育特征、蛹形态特征及蛹发育后期卵巢的超微结构。结果表明:红颈常室茧蜂蛹期为12～15 d,其中雌蛹期比雄蛹期长2～3 d。根据其形态特征,可将蛹划分为预蛹期、第一蛹阶段、第二蛹阶段、第三蛹阶段。蛹期发育前9 d,蛹期组织结构开始分化形成,成蜂的外部形态基本显现,但性别难以区分;蛹期发育至10～14 d,可通过幼蜂体表颜色的变化或腹部末端的形状区分性别,在相同的适宜温度条件下,雌蜂比雄蜂颜色深,雌蜂腹部末端比较尖,有突出的产卵瓣,雄峰腹部末端钝圆,无凸起;雌蜂卵巢在化蛹后的第11天开始形成,卵巢初期的形状如细丝,此时卵巢管已开始初步分化,但卵室尚未分化;蛹发育至第12天时,卵巢管逐渐加粗,卵室开始分化;第13天时,卵巢管、卵室数量逐渐增多;第14天卵巢基部开始有少量成熟卵子产生,呈乳白色。10～12 d,雄蜂腹部末端绒毛逐渐增多,体壁变硬,逐渐角质化,虫体可活动,雄蜂胸部略带黑色,翅逐渐伸展开,整个虫体呈浅红棕色。本研究结果明确了红颈常室茧蜂蛹发育的形态变化过程,提出了蛹期雌雄区分的方法,叙述了蛹后期卵巢发育特征,为研究该蜂繁殖机理奠定了形态学基础。     

亚麻籽油中亚麻酸的提取与纯化

研究采用尿素-硅胶和氯化亚铜-硅胶两次层析亚麻籽油,结果表明:尿素-硅胶层析后,亚麻籽油中只含有油酸、亚油酸和亚麻酸;氯化亚铜-硅胶层析后得到了纯度高于90%的亚麻酸产品。运用外标定量法,以亚麻酸甲酯为标准品,样品总亚麻酸在0. 045～0. 677 mg/m L范围内回归方程为:Y=782 59x-686 8(R2=0. 999 9)。本研究为今后亚麻酸的纯化研究及工业生产提供相关的理论依据和新的思路。     

Wnt/β- catenin信号通路在细菌致病中的作用

Wnt/β-catenin信号通路是一条高度保守的细胞内信号转导通路,具有介导细胞黏附、调控增殖、凋亡、参与炎症反应等多种生物学功能,在多种细菌的感染和致病过程中发挥重要作用。研究Wnt/β-catenin信号通路激活的分子机制及其在疾病发生、发展中的作用,不但可以了解细菌的致病机制,还为其治疗提供了新的靶点和策略。现将该信号通路在衣原体、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌致病中的作用作一概述。     

衣原体pORF5质粒编码蛋白致病机制的研究进展

衣原体(Chlamydia)是一类具有独特的两相发育周期、专性细胞内寄生的革兰阴性菌,能引起人类多种疾病。pORF5是衣原体隐蔽性质粒编码的分泌性效应蛋白。近年来研究证实,pORF5质粒编码蛋白是衣原体重要的毒力蛋白,与衣原体致病密切相关。现就衣原体pORF5质粒编码蛋白的生物学特性、致炎性作用、抗凋亡作用及促自噬作用作一概述。     

AG1478抑制剂对白鲫体色发育的影响

鱼类的体色由基本色素细胞相互配合而成,色素细胞主要有4种类型:黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞。AG1478是针对酪氨酸激酶(Tyr)的一种新型抑制剂。Tyr是黑色素生成过程中的关键酶,在黑色素细胞中呈特异性表达。本文主要阐述了白鲫四种色素细胞以及两种不同形态黑色素细胞的超微结构观察,探讨了AG1478抑制剂对白鲫早期体色发育的影响,实验结果表明抑制剂对白鲫早期体色发育没有明显影响。     

花鲫早期体色发育和几个体色相关基因在不同鲫的表达分析

红白花鲫胚胎发育期先观察到黑色素细胞的发生,孵化出膜后先后出现黄色素细胞、红色素细胞及虹彩细胞。1月龄花鲫幼苗体色呈浅青灰色,2月龄前后,花鲫皮肤黑色素细胞逐渐减少,体色发生“青转花”的变化,3月龄时基本形成红白镶嵌的成体体色。克隆获得了鲫Slc7a11和Pnp4a体色基因的全长cDNA。鲫Slc7a11全长1782bp,编码496个氨基酸,与斑马鱼Slc7a11基因氨基酸同源性达93.7%;鲫Pnp4a全长1535bp,编码291氨基酸,与斑马鱼Pnp4a基因氨基酸同源性达95.1%。RT-PCR检测了Mitfa、Tyr、Slc7a11和Pnp4a在白鲫、红鲫、花鲫三种不同体色鲫胚胎及成体组织中的表达,分析结果显示:花鲫和红鲫一样有一个黑色素消退过程,鲫Slc7a11和Pnp4a体色基因与斑马鱼Slc7a11和Pnp4a具有高度同源性,花鲫成体皮肤组织也和红鲫成体皮肤组织一样检测到了Mitfa和Tyr的表达。Pnp4a在不同鲫的不同体色发育时期和不同组织都有表达,Slc7a11在不同鲫的不同体色发育时期均有表达,但在不同鲫的成体皮肤组织中均未表达。