烟草二脂酰甘油酰基转移酶基因(NtDGAT2)的克隆与功能分析

二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT2)是植物储存油脂生物合成过程中的关键酶,对种子储存油脂累积具有重要的生理作用。本文采用电子克隆与实验相结合的方法,从烟草种子cDNA中克隆到DGAT2基因的开放阅读框序列,命名为NtDGAT2(GenBank登录号JX843807),其序列长999bp,编码332个氨基酸。多序列比对和进化分析表明该基因编码蛋白与其他植物DGAT2具有较高相似性和典型的DGAT2结构域。利用Real-time PCR定量表达分析显示Nt-DGAT2在烟草种子、花、茎、叶和根里面都有表达,且在发育中的种子和花的发育过程大量表达。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有DGAT酶活性。     

植物二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)研究进展

三酰甘油(TAG)是油料作物最主要的储藏脂类,二酰甘油酰基转移酶(DGAT,EC2.3.1.20)是TAG合成途径的限速酶,其主要作用是催化二酰甘油加上酰基脂肪酸形成三酰甘油.在植物中已发现了3种不同类型的DGAT基因,分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3.该文对近年来国内外有关植物DGAT相关基因及其蛋白分类、定位、结构及其在脂肪酸合成、种子发育与萌发、幼苗发育、叶片新陈代谢等过程中的作用等研究进展进行综述.为提高油料作物种子油含量以及特定脂肪酸积累提供理论参考.     

油葵含油量相关基因在烟草中的表达

采用RT-PCR和RACE技术从油葵(Helianthus annuus L.)种子中克隆了DGAT基因的cDNA全长序列,命名为HaDl(GenBank登录号为HM 015632).将HaDl与CaMV 35S组成型启动子融合,构建植物表达载体pBI-HaDl,通过根癌农杆菌介导转化烟草.对转基因植株进行GUS及PCR检测,同时采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析转基因烟草叶片中脂肪酸各成分的含量.结果表明:HaDl基因cDNA全长1 936 bp,最大开放阅读框为1 524 bp,编码507个氨基酸;推测的氨基酸序列与其它植物已报道的DGAT1基因的氨基酸序列一致性为70%～80%,具有DGAT1蛋白保守的二酰甘油结合基序"HKWIVRHLYFP",因此HaDl基因属于DGAT1基因家族.GUS活性染色及PCR检测均证明外源HaDl整合到烟草基因组并成功表达.转基因烟草叶片脂肪酸含量测定发现,油酸、软脂酸和硬脂酸的含量得到提高,推测HaDl是植物油脂合成相关的重要基因.     

牡丹DGAT基因的克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE技术,从牡丹种子中克隆得到1个二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT),命名为PaDGAT1(GenBank登录号为MG214258)。PaDGAT1基因cDNA全长为2 028bp,包含1 554bp开放阅读框,编码517个氨基酸。PaDGAT1蛋白属于疏水性碱性蛋白,分子量为58.86kD,理论等电点为8.62,二级结构预测表明,无规则卷曲和延伸链是该蛋白的主要结构元件。氨基酸序列对比分析表明,PaDGAT1基因编码的蛋白属于DGAT1亚家族,与油橄榄(Olea europaea)的DGAT1蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量分析结果表明,PaDGAT1基因在花芽中表达水平较高,在叶、茎和未发育子房中表达水平较低;在种子发育过程中,PaDGAT1基因表达水平呈现出升高-降低-升高的趋势,其中在发育28d时表达水平最高,随后其表达水平逐渐减低,在种子发育70d时又升高,至发育末期的85d时表达水平升高至较高水平;在种子收获后,常温存放7d时,PaDGAT1基因表达水平最高,随后其表达水平逐渐下降。结果推测,DGAT基因在牡丹种子的油脂合成中起重要的调控作用。     

油茶种子发育期油脂合成积累的源汇基因协同表达

为探讨油茶种子油脂的合成积累与源汇基因表达间的关系,以高油品系‘MY003’和低油品系‘MY008’的不同发育时期(6月2日、7月4日、8月5日、9月3日)种子为材料,利用氯仿甲醇法测定含油率,采用qRT-PCR技术分析油脂合成源基因(GPD1)和汇基因(DGAT1和DGAT2)在高低油种子间的表达差异及其对油脂合成积累的影响,为进一步研究油茶种子油脂合成积累的分子机制提供理论依据。结果显示:(1)油茶种子含油率均处于逐渐上升趋势(0.16%~24.1%),并在7月4日以后开始迅速上升,且‘MY003’种子含油率一直高于‘MY008’。(2)在‘MY003’种子中GPD1、DGAT1和DGAT2基因表达量均明显高于‘MY008’,DGAT1和DGAT2在源基因GPD1高水平表达后仍出现表达高峰;源基因GPD1在种子发育初期高表达,促进了TAG前体G3P的高效合成,而汇基因DGAT1和DGAT2在种子发育后期高表达,则促进了TAG的高效积累,GPD1与DGAT1、DGAT2之间呈正相关关系。研究表明,油茶种子油脂的合成积累来源于源基因GPD1和汇基因DGAT1与DGAT2的协同高表达。     

种子特异表达异源DGAT1基因提高大豆种子含油量和营养品质

为提高大豆Glycine max种子含油量和营养品质,文中以二酰甘油酰基转移酶1(Diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1)基因为遗传修饰靶标。将来自高油植物斑鸠菊Vernonia galamensis L.编码DGAT1酶蛋白的c DNA克隆Vg DGAT1A在大豆种子特异超表达。连续选择获得高代(T7)Vg DGAT1A转基因大豆株系。转基因株系表型鉴定显示,在大豆种子发育中期(30–45 DAF),Vg DGAT1A高表达,相应地DGAT酶活性是非转基因野生型和空载体转化对照的7.8倍。转基因成熟种子含油量比对照提高了5.1%,淀粉含量比对照减少2%–3%,蛋白质含量与对照无显著差异。此外,转基因大豆种子百粒重(14.5 g)和种子萌发率(95.6%)与对照亦无明显差异。种子油脂脂肪酸成分分析显示,转基因大豆种子油中抗氧化的油酸(C18:1Δ9)含量比对照提高8.2%,相应地易氧化的亚油酸(C18:2Δ9,12)和亚麻酸(C18:3Δ9,12,15)分别减少6%和2%。这些数据表明,种子特异超表达外源Vg DGAT1A基因,打破了大豆种子含油量和蛋白质含量的负连锁,显著提高种子含油量且未导致蛋白含量降低。转基因大豆种子重量和萌发率亦未显负效应,而且种子油脂抗氧化性和营养品质得以改善。研究表明应用这一高酶活性Vg DGAT1A的基因工程是提高种子含油量和改善油脂品质的一条有效途径。     

高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶2同源基因的克隆、表达和活性分析

[背景] 高山被孢霉（Mortierella alpina）是一种可积累大量花生四烯酸（Arachidonic Acid,AA）的产油丝状真菌,其所产脂肪酸主要被组装到甘油骨架上以三酰甘油（Triacylglycerol,TAG）形式存在。二酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol Acyltransferase,DGAT）是TAG生物合成途径的关键酶,对于高山被孢霉TAG的生产具有重要意义。[目的] 通过探究高山被孢霉DGAT2在TAG生物合成方面的功能特点,以期为提高产油真菌的TAG产量及改善TAG的脂肪酸组成提供参考。[方法] 利用序列比对在高山被孢霉ATCC32222基因组中筛选出2个编码DGAT2的候选基因MaDGAT2A/2B,在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中异源表达后进行功能分析,并在外源添加AA条件下通过检测TAG产量进一步分析MaDGAT2A/2B的活性,最后在高山被孢霉中同源过表达MaDGAT2A/2B,通过检测重组菌总脂肪酸产量及组分以分析MaDGAT2A/2B的体内活性。[结果] MaDGAT2A在S. cerevisiae中异源表达时,重组酵母菌TAG的产量达到细胞干重的3.06%,为对照组的4.91倍;而MaDGAT2B未明显提高重组酵母菌TAG的产量。在外源添加AA时,MaDGAT2A/2B均可显著促进重组酵母菌中TAG合成,表达MaDGAT2A的重组酵母菌TAG含量为对照组的3.67倍,表达MaDGAT2B的重组酵母菌TAG含量为对照组的2.61倍。MaDGAT2A/2B在高山被孢霉中过表达对其总脂肪酸产量无显著影响,但可显著提高总脂肪酸中AA的含量,AA占总脂肪酸比例最高达到39.15%,相比对照组提高16.14%。[结论] MaDGAT2A/2B可以参与TAG的生物合成,表明2个候选基因编码的蛋白具有DGAT活性,并且可提高高山被孢霉脂肪酸中AA的含量,对于改善产油真菌的脂肪酸组成从而提高其应用价值具有重要意义。     

拟南芥TAG1基因对脂类合成调控作用的研究进展

三酰甘油（TAG）是真核生物中能量贮存的最主要形式。植物中贮存的三酰甘油是食用油类和工业用油的主要来源。TAG1基因的表达产物甘油二酯酰基转移酶（DGAT）能够调控三酰甘油的合成。as11是TAG1基因突变获得的脂类代谢相关突变体。该文概述了拟南芥（Arabidopsis thaliana）突变体as11的生物学特征及TAG1基因对脂类合成调控的最新进展。     

油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。     

甘蓝型油菜BnDGAT1基因表达的特异性分析

该研究从甘蓝型油菜中克隆获得了二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT）,命名为BnDGAT1,并对该基因编码的氨基酸序列、蛋白结构域和系统进化树进行分析。结果表明:该基因编码的氨基酸序列包含二酰甘油酰基转移酶等多个功能结构域,并具有8个疏水跨膜结构区。系统进化分析表明,BnDGAT1与芥菜、拟南芥、旱金莲中DGAT1系统进化关系相对较近。利用定量PCR对BnDGAT1基因的RNA转录表达分析表明,在不同组织和角果的不同发育阶段,BnDGAT1基因的表达具有组织特异性,且在角果不同发育阶段,其RNA转录水平随着角果发育的成熟表达明显下调。     

巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析

为了解蔗糖合成酶在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生长和发育过程中的功能,利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了蔗糖合成酶基因,并对基因的表达特征进行了分析。结果表明,从巴西橡胶树中克隆了两个蔗糖合成酶基因(HbSS1和HbSS2),HbSS1全长2864 bp,编码806个氨基酸;HbSS2全长2815 bp,编码811个氨基酸。两个基因编码的蛋白具有典型的植物蔗糖合成酶结构特征,包含1个磷酸化位点和两个保守的功能域。半定量RT-PCR分析表明,HbSS1和HbSS2在各组织器官中均有表达,其中HbSS1在叶中的表达量最高,HbSS2在树皮中的表达量最高,这说明HbSS1和HbSS2可能参与了各组织的生长和代谢过程,且功能有所分化。     

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。     

续随子ElFAD2基因的序列及表达特性分析

为了研究油酸脱氢酶(FAD2)基因ElFAD2对续随子(Euphorbia lathyris L.)中不饱和脂肪酸合成的调控作用,该研究在续随子转录组数据的基础上经筛选获得ElFAD2基因序列,并对其序列及表达特性进行分析。序列分析结果显示,ElFAD2基因全长1 907 bp,ORF长1 152 bp,共编码383个氨基酸,包含有典型的脂肪酸去饱和酶结构域。续随子ElFAD2蛋白理论等电点为8.08,属于稳定蛋白,包含4个跨膜区和3个保守的组氨酸簇。基于FAD2的系统发育分析表明,续随子与同科植物乌桕(Triadica sebifera L.)的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析发现,ElFAD2基因在不同器官中均有表达,且在花后15 d的种子中表达量最高,在叶与花后30 d及45 d种子中的表达量相当,而在根、茎、花中的表达量最低。该研究结果为深入探讨续随子ElFAD2基因的生物学功能提供了基础数据,也为解析续随子种子中脂肪酸合成的分子机制奠定了基础。     

基于转录组测序对油茶角鲨烯合酶基因的克隆及分析

油茶是中国重要的木本油料树种,而角鲨烯在茶籽油中含量多少是茶油品质的重要指标,为提高油茶角鲨烯含量,以油茶种子转录组测序为基础,根据Unigene设计SQS基因RACE引物,克隆出基因全长共1 490 bp,开放阅读框1 266 bp,编码422个氨基酸,将氨基酸序列与其他植物SQS进行比对,构建进化树,分析物种间进化关系,进行蛋白质的生物信息学分析,包括蛋白质结构特点、理化性质、氨基酸组成及稳定性分析; 跨膜区域分析; 信号肽识别位点; 磷酸化位点; 二级结构及功能; 结构域分析。通过转录组测序和荧光实时定量分析了SQS基因在油茶种子发育各时期表达量变化规律,并提取各时期油脂,测定角鲨烯含量,发现两种基因表达量分析方法的结果有一致的变化趋势,且与各月份间角鲨烯含量有相同的变化规律。证明了转录组测序的有效性,并推测油茶角鲨烯合酶基因的表达量变化与角鲨烯含量的多少有直接关系,为后续从分子手段提高茶籽油中角鲨烯含量提供了理论基础。     

Characterization of VAMP-2 gene from marine teleostean, Lateolabrax japonicus

The whole length SPV2 gene of 715 bp, encoding VAMP-2 protein of 110 amino acids from Japanese sea perch, Lateolabrax japonicus, was obtained by using both RT-PCR and anchored PCR strategies while we initiated the structural and functional study on SNARE proteins in marine teleostean. Analysis of the deduced amino acid sequence indicated that SPV2 has its core arginine residue, a potential N-linked glycosylation site near its N-terminal, and one transmembrane domain in its C-terminal. Advanced structural analysis of bioinformatics approach predicts a coiled-coil α-helix backbone as the characteristic of SPV2 main conformational structure, identical to the structure of rat VAMP-2 obtained by crystallography. Semi-quantitative RT-PCR revealed that SPV2 was generally expressed in 10 neural and non-neural tissues, with the highest concentration in brain and the least in muscle.     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

北美鹅掌楸CPP转录因子家族LtTCX2基因的克隆与分析

CPP(cystein-richpolycomb-likeproteinor Tesmin/TOS1-like)家族属于成员数目较少的一类转录因子基因家族,含有保守的富含Cystein的CRC结构域,在植物发育进程中,主要参与花发育、细胞分裂、分子进化等。为了探索CPP转录因子家族在北美鹅掌楸花发育中的作用,该文以北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)为材料,采用RACE技术克隆出1个CPP-like家族基因,命名为LtTCX2,全长2 866 bp。通过NCBI网站在线分析,ORF长2 424 bp,编码了807个氨基酸,含2个保守的TSO1-like CXC结构域,分子量为88 699.25 Da,理论等电点为5.83,不稳定系数为62.38,疏水性平均值为-0.619,预测为亲水性蛋白、非跨膜蛋白、核蛋白,不含信号肽及切割位点。氨基酸比对及系统进化分析结果显示,LtTCX2与其他物种的CPP家族TCX蛋白具有较高的同源性,与亚洲莲(Nelumbo nucifera)的NnTCX2、胡杨(Populus euphratica)的PeTCX2进化关系最近。荧光定量PCR结果显示,LtTCX2基因在叶片中表达量最高,在萼片、花瓣中几乎不表达,表达量由高至低如下:叶片、花芽、雌蕊、雄蕊、茎、根、花瓣、萼片。以上结果说明,LtTCX2属于较古老、保守的一类基因,可为从分子生物学层面研究鹅掌楸属植物系统进化提供一定的理论依据。     

春兰CgSEP3基因的克隆和表达分析

该研究采用RT-PCR和RACE技术从春兰(Cymbidium goeringii)中分离到1个SEPALLATA3(SEP3)基因。序列分析表明,该基因含有1个732bp的开放阅读框(ORF),共编码243个氨基酸。系统进化树分析显示,该基因是MADS-box基因家族AP1/AGL9组SEP的同源基因,其编码蛋白与其它植物SEP3类蛋白具有较高的一致性,命名为CgSEP3(登录号为KF924272)。实时荧光定量分析表明,CgSEP3在春兰花器官中均有表达,其中在唇瓣、侧瓣和萼片中的表达量较高,在子房和蕊柱中的表达量较低;而且CgSEP3在花发育各个时期都有表达,在1~2cm的花芽中表达量最高,在盛开的花中的表达量最低。研究认为,CgSEP3基因可能在春兰花瓣和萼片的形成过程中具有重要作用。