一株高产纳豆激酶菌株的鉴定与分析

鉴定高产纳豆激酶菌株Td,分析纳豆激酶的分子特征。利用菌体形态、生理生化特征、以及分子生物学方法对菌株Td进行鉴定;并采用MALDI-TOF质谱测定与分析、SDS-PAGE和纤溶活性测定等方法检测纳豆激酶特性,利用PCR方法扩增纳豆激酶的基因全长。结合菌体形态、生理生化特征和16S r DNA、gyr A基因序列、DNA-DNA杂交率等实验结果,鉴定菌株Td为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis);菌株Td发酵产生的纳豆激酶产量可达300 mg/L以上,占发酵液总蛋白的40%以上;纤溶活性达230 U/m L以上;氨基酸序列与subtilisin E的序列相似性最高;基因全长序列为1 143 bp。枯草芽孢杆菌枯草亚种Td是一株高产、高活性纳豆激酶的产生菌,具有优良的工业化开发价值。     

芽孢杆菌基本特征、16S rRNA对比分析及特异性基因挖掘

为了研究10种芽孢杆菌的基本特性,下载到70条芽孢杆菌属细菌的16S r RNA序列,通过对比芽孢杆菌的基本特征和16S r RNA序列种内和种间相似性,发现基本特征很难区分这10种菌株。16S r RNA序列种内相似性最高为100%,最低的是B.amyloliquefaciens,种内分化较明显,最低值为90.85%,种间相似性最高的2个菌株是B.subtilis strain 168和B.amyloliquefaciens strain BCRC 11601,最高值为99.66%,最低为92.01%。B.subtilis、B.amyloliquefaciens、B.anthracis、B.cereus、B.methylotrophicus、B.atrophaeus之间某些菌株的16S r RNA相似性极高,通过16S r RNA序列很难区分,B.coagulans的16S r RNA特异性最好。同时本研究提供了gyr A、gyr B、rpo A、yya R、yya O等多个能够准确鉴定的特异性基因,为快速鉴定菌种提供了便利。     

乳杆菌喂食大鼠后目标菌克隆筛选与确认

目的确认乳杆菌能否顺利通过胃酸屏障并在肠道内定植为进一步研究乳杆菌对大鼠的生理代谢影响做基础,为乳杆菌菌株的应用提供有效依据。方法采用浓度梯度药物平板筛选利福平耐受菌株,用耐利福平（15 mg/L）乳杆菌菌株喂食SD雄性大鼠并采集其新鲜粪便,在耐药平板上筛选出能在大鼠结肠内定植良好的耐药菌株,并得到16S rDNA的鉴定结果,利用16S rDNA序列同源性分析对乳酸菌进行分类鉴定。结果粪便中检测出的乳杆菌耐药菌株经纯化鉴定后与所喂食的乳杆菌同源。结论实验所筛选出的耐利福平乳杆菌在大鼠结肠内成功定植。     

葡萄藤叶青贮中乳酸菌的分离与鉴定

为了筛选出性状优良的乳酸菌菌株,本试验以实验室纯培养方式从葡萄藤叶自然发酵的青贮中分离鉴定乳酸菌。经过菌落形态、细胞形态、生理生化鉴定和16S r DNA基因序列以及系统发育树的分析,从葡萄藤叶青贮中分离出5株乳酸菌,其中菌株P-1. 2和P-2. 2为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus),菌株P-1. 7为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus),菌株P-2. 1为粪肠球菌(Enterococcus faecium),菌株P-2. 3为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。测定产酸速率和生长速率,发现菌株P-2. 1的产酸能力和生长性能最好。     

1株抗流感病毒H1N1红树林内生放线菌的分离与鉴定

采用CPE-MTT方法筛选从海漆叶部分离到的具有抗H1N1病毒活性的内生放线菌,对活性较强的菌株HA12207进行形态学和生理生化特性的研究,并对其16S r DNA序列进行系统发育分析。结果表明,菌株HA12207发酵液稀释20倍后对H1N1病毒的抑制率达到76.5%,HA12207与Tsukamurella tyrosinosolvens IMMIBD-1397T(YI2246)的形态和生理生化特征最为接近,与其16S r DNA序列相似性为99.9%,且在发育树上聚为一个分支。因此将菌株HA12207鉴定为T.tyrosinosolvens,其发酵液具有较强的体外抗H1N1病毒活性,值得进一步研究。     

高效柴油降解菌Acinetobacter sp.W3分离鉴定及降解酶基因扩增分析

从柴油污染的海水样品中分离高效柴油降解细菌,分析菌株对柴油的降解能力及降解酶基因,为海洋柴油污染的生物修复奠定基础。选取浙江定海港柴油污染的海水样品,进行降解菌的富集培养;采用常规方法分离筛选高效柴油降解菌。利用革兰氏染色、形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA分析等方法对降解菌株进行种属鉴定。采用紫外吸收法测定菌株对柴油的降解率。采用PCR方法、核酸序列测定和比对,对其降解酶基因进行扩增分析。筛选出一株高效降解菌,形态学观察及生理生化鉴定初步确定为不动杆菌。16S rDNA序列分析及比对结果表明,其16S rDNA序列与威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)属的序列同源性达到99.7%,命名为不动杆菌W3(Acinetobactersp.W3),该菌对柴油的7 d降解率达到84.7%。PCR方法从Acinetobactersp.W3菌株中的基因组DNA和质粒DNA上扩增到了大小为540 bp的烷烃羟化酶基因alkB和864 bp的CYP153A部分DNA片段,分别与Acinetobacter venetianus1-D-2的alkB和Acinetobactersp.OC4、Acinetobactersp.EB104的CYP153具有99%和98%的同源性。从定海港口柴油污染海水分离得到一株高效柴油降解菌Acinetobactersp.W3,该菌属于不动杆菌属,含有烷烃降解酶基因,能高效降解柴油污染物,有望应用于海水柴油污染的生物修复。     

1株血红蛋白分解菌的分离鉴定及其蛋白酶活力测定

为了获得能够有效降解利用屠宰场废弃血液的功能菌株,以日喀则地区屠宰场废弃血液堆积土壤样品为材料,将样品稀释涂布接种在血平板上进行分离,挑取水解圈最大的菌落进行平板划线纯化。对分离菌株进行形态学、生化反应试验、16S rDNA序列鉴定并测定其蛋白酶活性。筛选出1株能够高效降解血红蛋白的菌株命名为NwMCC01910042,该分离菌株为革兰阳性杆菌,V-P(Voges-Proskauer)试验阳性,枸橼酸盐利用、淀粉水解、明胶液化、16S rDNA序列系统进化分析显示NwMCC01910042菌株与Bacillus licheniformis ATCC 14580株的序列相似性为99.79%,与Bacillus licheniformis MSL3076株的序列相似性为99.30%,为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis),该菌株的16S rDNA序列已提交至GenBank,准入编号为MN 176417,其蛋白酶活力为188.63 U/mL。利用微生物降解生产氨基酸有机肥的关键是筛选蛋白酶的高产菌株,NwMCC01910042株菌有望作为将废弃血污降解为氨基酸的候选功能菌株。     

干酪乳杆菌的近缘种及亚种部分看家基因的系统发育分析

【背景】16S rRNA基因序列分析已广泛应用于细菌的分类鉴定,但是存在一定局限性,而使用看家基因作为分子标记在近缘种及亚种间的系统发育分析中具有其独特的优势。【目的】研究16S rRNA、uvr C (核酸外切酶ABC,C亚基)和mur E (UDP-N-乙酰胞壁酰三肽合酶)基因序列对干酪乳杆菌的近缘种及亚种的区分能力。【方法】采用分离自传统发酵乳中的6株干酪乳杆菌为研究对象,选取uvr C和mur E基因片段,通过PCR扩增、测序,结合已公布的干酪乳杆菌的近缘种或亚种的相应序列计算遗传距离、构建系统发育树,并与16S rRNA基因序列分析技术进行比较。【结果】研究发现Lactobacilluscasei及相近种间的uvr C、mur E和联合基因(uvr C-mur E)构建的系统发育树拓扑结构与16S rRNA基因结果基本一致,区别在于相似性的不同,其分别为79.00%-99.16%、89.08%-99.20%、76.56%-99.69%和99.58%-100%。基于16S rRNA基因不能区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种,而看家基因uvr C和mur E基因序列能够很好地区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种,并且将uvr C和mur E基因串联使用后,试验菌株与参考菌株的分类关系更加清晰。【结论】联合基因(uvr C-mur E)可作为16SrRNA基因的辅助工具用于干酪乳杆菌的近缘种及亚种的快速准确鉴定。     

黄酒浸米液中产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选和鉴定

从黄酒浸米液中筛选出一株产γ-氨基丁酸的菌株Tpxj-01,采用生理生化实验、形态学观察以及16S r DNA序列分析对Tpxj-01进行鉴定,结果表明该菌株为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。高效液相色谱分析对Lactobacillus plantarum Tpxj-01发酵产γ-氨基丁酸的能力进行定量测定,发酵液中γ-氨基丁酸浓度为1.02 g/L。筛选获得的乳酸菌Lactobacillus plantarum Tpxj-01生物安全性高,能应用于食品工业,具有较好的γ-氨基丁酸生产潜力。     

产β-淀粉酶菌株的筛选及β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

从淀粉厂附近的土壤中筛选到一株能够利用淀粉的细菌,对该细菌进行生理生化检测和16S r DNA同源性比对,分析该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。利用基因克隆技术得到了该菌株的β-淀粉酶基因,该基因含有一个约30个氨基酸的信号肽序列。将该β-淀粉酶基因重组进入质粒p ET-28a中,转化进入E.coli BL21(DE3)中进行表达。检测表达结果显示得到了重组后的β-淀粉酶蛋白质,重组酶的酶活力提高了53.9%。     

一株丁二酸高产菌株的筛选和鉴定

从瘤胃中筛选到一株高产丁二酸生产菌株,为革兰氏阴性菌,短杆状,无芽孢,不运动,兼性厌氧.经形态学、生理生化鉴定和基于16S rRNA序列的系统发育分析,该菌株为巴斯德菌科的产琥珀酸放线杆菌,是产琥珀酸放线杆菌CCUG 43843的变种,二者的序列相似性为99.93%,命名为产琥珀酸放线杆菌A3.5L发酵罐分批发酵实验表明,当发酵培养基中葡萄糖浓度为50g/L时,产琥珀酸放线杆菌A3可以产25.8g/L丁二酸,具有较好的丁二酸生产潜力.     

一株丁二酸高产菌株的筛选与选育

旨在提高丁二酸发酵生产水平,通过初筛、复筛从土壤中分离得到了高产丁二酸菌株,发酵结束后利用高效液相色谱法检测丁二酸的产率为34.45%。对菌株进行紫外诱变选育,结果表明,在底物葡萄糖的浓度为100 g/L时,丁二酸的产率提高了46%,达到了50.30%,残糖低于10 g/L。经形态学特征、生理生化指标测定以及16S r DNA序列分析等,鉴定该菌株为放线杆菌。     

同步脱氮除硫菌的筛选鉴定及其生长特性研究

为促进反硝化脱硫工艺的工程化应用,从稳定运行的反硝化脱硫UASB中筛选出2株高活性自养反硝化菌H3和H7,并对其进行了鉴定和生长及反硝化特性的研究。结果表明,2株菌均为革兰氏阴性菌,16S r DNA序列分析表明,分别与Pseudomonas stutzeri CONC12和Pseudomonas stutzeri 19smn4相似性为99.6%和98.9%。结合生理生化特性和16S r DNA序列分析,确定两菌株都为Pseudomonas stutzeri。对两菌株的生长和反硝化特性研究表明,菌株H3和H7的生长最适起始p H为6.94和6.88,最适反硝化p H分别为6.77和6.56。H3和H7的最适生长温度为30.4℃和30.6℃,最适反硝化温度分别为31.4℃和31.2℃,两株菌种都为非耐盐菌株。     

8株光合细菌的鉴定及其系统进化关系分析

目的为8株光合细菌(photosynthetic bacteria,PSB)作为益生菌株提供系统资料。方法用常规方法对8株PSB菌株的形态、培养特性及生理生化特征进行鉴定,同时定性分析菌株产生的类胡萝卜素和CoQ,测定菌株16S DNA序列并分析其系统进化关系,在GenBank中获取了8个16S DNA序列号。结果菌株鉴定结果表明:菌株2C、2c和13ing为沼泽红假单胞菌,Ga、Il106、WS8N为类球红细菌,MT1131为荚膜红细菌,rub为深红红螺菌。基于菌株16S DNA序列的系统进化树显示,同一种菌并不总是聚为一簇,但相隔较近;种属完全不同的菌株,尽管序列相似性高达97%以上,在系统进化树上相隔较远。结论8株PSB菌株的鉴定和系统进化关系分析结果为后续研究提供了背景资料,同时菌株在GenBank中获得的16S DNA序列号为菌株作上了生物标记,也为菌株的产权保护提供了依据。     

乳扇制品中乳酸杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列同源性分析

目的乳扇是云南大理白族的一种传统乳制品,明确大理乳扇制品中乳杆菌的多样性及优势种群分布,为科学利用奠定基础。方法采用表型鉴定及16S r RNA鉴定方法,对10个家庭作坊的大理乳扇制品中的乳杆菌进行了分离鉴定。结果共分离到50株乳杆菌,通过表型鉴定为8个种,包括植物乳杆菌10株、德氏乳杆菌7株、发酵乳杆菌6株、干酪乳杆菌6株、棒状乳杆菌4株、鼠乳杆菌2株、弯曲乳杆菌3株和食果糖乳杆菌2株;06422和06430两株表型鉴定未能定种,进一步通过16S r RNA鉴定为植物乳杆菌和马酒乳杆菌,06422株与植物乳杆菌L.arizonensin、L.pentosus和L.plantarum P158的同源性分别是100%、100%和99.9%,与乳杆菌属其它种的同源性为83.4%(L.gallinarum)至93.5%(L.brevis),06430株与L.kefiranofaciens.subsp.Kefirgranum的16S r RNA同源性是99.9%,与乳杆菌属其它种的同源性为83.7%(L.plantarum P158)至96.3%(L.acidophilus)。结论大理乳扇制品中有9种乳杆菌,其优势种群为植物乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌和干酪乳杆菌等四种。     

细菌群体感应抑制活性微生物Zou 03的筛选与鉴定

从近海区生态环境中分离纯化98株海洋菌株,以根癌农杆菌WCF47为敏感检测菌株,筛选出1株具细菌群体感应抑制活性的菌株Zou03,对其进行形态、生理生化特征鉴定和16S rDNA分子鉴定。结果显示,Zou03具枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的典型特征,其16S rDNA序列通过对比分析,与GenBank中枯草芽胞杆菌16SrDNA的部分序列同源性为100%。综合形态、生化特征及16S rDNA序列对比分分析,鉴定菌株Zou03为枯草芽胞杆菌。表明近海区生态环境中存在具有抑制细菌群体感应活性的微生物,有利于海洋微生物资源开发,为以致病菌群体感应系统为靶点的新型疗法提供新技术。     

一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定

【目的】对一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定。【方法】采用改良的NA培养基分离纯化菌株,并通过菌体的形态结构观察、生理生化试验及其16SrDNA序列同源性分析对其进行鉴定。【结果】菌株SWFU01的形态特征及生理生化试验结果与解淀粉芽孢杆菌[Bacillus amyloliquefaciens(Fukumoto)Priest et al.]的描述基本相同;16S rDNA序列分析表明,该菌株与解淀粉芽孢杆菌JS在同一系统发育分支,其同源性为99.28%。【结论】综合形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析的研究结果,菌株SWFU01被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。     

D-乳酸脱氢酶基因克隆及其表达

构建了一株产D ,L 乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD 1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ1 4 4作为宿主 ,在厌氧条件下通过互补筛选获得乳酸脱氢酶基因 (ldh) ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE)检测证明其阳性克隆表现出D 乳酸脱氢酶 (D LDH)活性。核酸序列分析表明 ,ldhD的ORF编码 331个氨基酸残基组成的蛋白质有两个保守区域 ,其中V1 47～D1 76 区是NADH的结合位点 ,R77～E1 0 7区据报道是酶的活性部位。该菌株D LDH和D羟基异己酸脱氢酶 (D HicDH)属于NADH依赖性脱氢酶家族 ,ldhD和其他乳杆菌属的ldhD及D HicDH基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核酸序列相似性最高达 4 9 33% ,氨基酸序列相同性最高为 4 2 % ,是一个新的D 乳酸脱氢酶基因     

多功能固氮菌筛选及其在土壤生态修复中的应用

以固氮酶和ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,1-氨基环丙烷-1-羧酸)脱氨酶活性为指标筛选功能菌株,研制菌剂,用于修复生荒地土壤生态。采用乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;比色法定量测定ACC脱氨酶活性;PCR扩增得到菌株16S r RNA,通过序列分析、比对研究菌株的系统发育地位;通过形态、生理生化特征和16S r DNA序列比对鉴定菌种。结果显示,筛选到固氮酶活性大于9 nmol/(h·mg)的菌株共计47株,其中43株的固氮酶活性大于阳性对照固氮菌剂生产菌株圆褐固氮菌ACCC11103。筛选到产生ACC脱氨酶的菌株20株,ACC脱氨酶活性为0.326-21.980μmol/(h·mg)。将筛选到的功能菌株接种小白菜测试促生效应,其中47株使普通白菜(Brassica campestris)鲜重增加。16S r RNA测序鉴定显示筛选到的51株功能菌株系统发育地位上属于农杆菌、节杆菌、芽孢杆菌、伯克氏菌、鞘氨醇杆菌、屈挠杆菌、剑菌、肠杆菌、溶杆菌、微球菌、类芽孢杆菌、叶杆菌、假单胞菌、根瘤菌、中华根瘤菌、芽孢乳杆菌等16属31种。选取高效菌株7012、7134、7144和7164作为核心菌株制备了固氮多功能菌剂,应用于生荒地,试验地土壤微生物数量显著提高,土壤蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶、纤维素酶、木聚糖酶活性极显著高于未施用菌剂的对照处理。多功能固氮菌制剂对于提高生荒地土壤生物活性、改善土壤生态环境具有重要作用和应用价值。     

津巴布韦烟叶中淀粉酶和蛋白酶产生菌的分离及鉴定

目的:从津巴布韦烟叶中分离产蛋白酶菌和产淀粉酶能力最高的菌株,并对其进行鉴定。方法:采用淀粉富集培养基和酪蛋白富集培养基分别分离津巴布韦烟叶中的产淀粉酶和产蛋白酶菌株,通过生理生化实验和16SrRNA序列分析鉴定分离的菌株。结果:产蛋白酶菌株菌体不透明、表面有褶皱,蛋白酶酶活为52.10±0.13 U/mL;产淀粉酶菌株菌体表面呈黏状,淀粉酶酶活为3.69±0.07 U/mL;产蛋白酶与产淀粉酶的2株菌均与枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列有100%的相似性,结合生理生化指标初步鉴定为枯草芽孢杆菌。结论:获得的2株菌在降解烟叶的蛋白质和淀粉过程中可能起重要作用。