小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系可转化人工染色体(TAC)文库的构建

可转化人工染色体(Transformation\|competent Artificial Chromosome,TAC)是具有克隆和转移大片段基因能力的新型载体,是植物基因克隆和转化的有效工具。为了克隆小麦抗白粉病基因和其它基因,本研究用TAC载体pYLTAC17构建了带有抗白粉病基因Pm21的小麦簇毛麦6VS/6AL易位系的基因组DNA文库。该文库包含210万个克隆,平均插入片段35kb,库容相当于普通小麦基因组的49倍。本文库以约1000个克隆组成1个混合池的方式保存在22块96孔平板,可用PCR方法进行文库的筛选。     

植物可转化基因组文库的发展和应用

在基因克隆时,如应用通常的一些基因组文库如ＹＡＣ、ＢＡＣ 和ＰＡＣ 等进行目的基因的筛选,在获得候选克隆后,通常进行亚克隆,然后对每个亚克隆逐一进行基因功能互补试验,不仅工作量大,而且有遗漏的可能。近年来,对一些通常的基因组文库载体进行改建,已发展了既可用于克隆,又能直接进行转化的载体,这将大大方便大片段ＤＮＡ的转移。     

以可转化人工染色体(TAC)载体为基础的百脉根基因组文库的构建及筛选

可转化人工染色体(transformation-competentartificial chromosome,TAC)载体是具有克隆和转移大片段DNA特征的新型载体,是植物基因克隆和转化的有效工具.该研究把它用于豆科植物百脉根(Lotus japonicus)基因组文库的构建.此文库由1.8×105个克隆组成,平均插入片段大小为15kb左右,约覆盖百脉根基因组6倍.文库保存在12块96孔板中,每个孔中约含150个不同的重组克隆.用与花发育相关的同源基因Ljcen1片段为探针,筛选得到6个阳性克隆,酶切后验证这些阳性克隆,结果表明这些克隆含有同一个基因片段.此基因组文库可直接用于植物转化,为百脉根功能基因组的研究打下基础.     

基因组文库的研究进展

基因组文库是分子克隆和基因组学的技术基础,它主要经历了噬菌体系列文库、人工染色体系列文库和多元载体系列文库三个阶段。介绍了λ噬菌体文库、cosmid文库、P1噬菌体及PAC文库、fosmid文库、YAC文库、BAC文库、MAC文库、HAC文库、BIBAC文库和TAC文库,罗列了部分文库的研究成果和发展情况,总结了基因组文库的发展进程,并对基因组文库向多基因发展作了展望。     

用克隆池PCR法筛选小麦 簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC文库获得抗病基因候选克隆

用根据抗病基因保守区设计的一对简并性引物,从小麦簇毛麦易位系6VS/6AL cDNA中PCR扩增获得一个具有抗病基因核苷酸结合位点（Nucleotide binding site, NBS）结构特点的DNA片段克隆N7。从小麦簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC（Transformationcompetent artificial chromosome, TAC）文库的22块96孔板提取所有2112个克隆池（每个池含约1000个克隆）的质粒,再根据N7的核苷酸序列设计一对特异引物,用克隆池PCR（pooled PCR）法经分级筛选从文库中获得一个阳性克隆。以N7为探针,通过Southern 杂交证实了该TAC克隆为真正含有抗病候选基因的克隆。研究结果表明克隆池PCR法对克隆数目巨大的基因组文库的筛选很有效。     

用克隆池PCR法筛选小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL基因组TAC文库获得抗病基因候选克隆

用根据抗病基因保守区设计的一对简并性引物,从小麦－簇毛麦易位系6VS／6AL cDNA中PCR扩增获得一个具有抗病基因核苷酸结合位点（Nucleotide binding site,NBS）结构特点的DNA片段克隆N7。从小麦－簇毛麦易位系6VS／6AL基因组TAC（Transformation-competent artificial chromosome,TAC）文库的22块96孔板提取所有2112个克隆池（每个池含约1000个克隆）的质粒,再根据N7的核苷酸序列设计一对特异引物,用克隆池PCR（pooled PCR)法经分级筛选从文库中获得一个阳性克隆。以N7为探针,通过Southern杂交证实了该TAC克隆为真正含有抗病候选基因的克隆。研究结果表明克隆池PCR法对克隆数目巨大的基因组文库的筛选很有效。     

猪基因组文库的构建及其生长激素基因的分离

本工作以长白猪为材料,分别用Charon28及EMBL3为载体,构建了猪的基因组文库。用牛生长激素基因为探针对基因文库进行筛选,由两个基因文库中各获得一个阳性克隆λPGH1,λPGH2。其后,以质粒pUCl9为载体对λPGHl进行了亚克隆。通过对亚克隆pPGH的酶切图谱及其Southern杂交结果的分折表明,在pPGH中含有完整的猪生长激素基因。     

大片段克隆载体研究进展

DNA克隆技术是分子生物学研究中一项重要的技术手段。自第一个质粒载体pSC1 0 1作为克隆载体以来 ,随着分子生物学技术的发展 ,克隆载体的整体结构、容载能力和转化效率都有了很大的改善。尤其是人类基因组计划的实施 ,产生了YAC和BAC克隆体系。随着植物基因组计划的进行 ,又产生了既能够克隆大片段DNA又能够将候选克隆直接通过农杆菌介导进行功能互补实验的载体。综述了几种常用大片段克隆载体YAC、BAC、BIBAC、PAC和TAC的特点及其应用 ,并对克隆载体的发展作了展望。     

Y染色体特异DNA序列及应用

DNA文库的建立及其应用于基因定位的可能性首先在基因组较小的生物(如果蝇)中得到证实。近年来原位噬菌斑和克隆杂交,改进的λ克隆载体以及体外包装系统等的发展,对于较复杂的基因组(哺乳动物)也进行了基因文库的建立和筛选。对复杂基因组中富集某一特定部分的文库的建立开始于七十年代末,被克隆的特定染色体DNA顺序文库代表全部基因组信息的结构亚单位,比整个基因组定位具有显著的优点。     

细菌人工染色体载体的发展和应用

细茵人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)是在大肠杆菌F质粒的基础上建成的高容量、低拷贝的质粒载体.BAC载体已广泛应用于基因组文库的构建及筛选、基因组测序、新基因的发现、图位克隆、BAC微阵列、转基因和动物品种资源保存等方面.本文综述了BAC载体的发展及其应用.