应用不同代次兔肾细胞培养风疹病毒松叶株的研究

目的为提高兔肾细胞产量用于增加风疹病毒生产。方法 SPF级家兔肾细胞经传代培养10代,对不同代次兔肾细胞进行遗传稳定性、外源因子及兔脑原虫检测后接种风疹病毒松叶株(Matsuba strain)的试验。结果兔肾细胞产量得到提高,由1对兔肾平均生产1瓶细胞增加为8瓶,细胞核型检查传至第10代的细胞染色体数目与初代细胞一致,细胞培养物均一性提高。第0～第3代细胞病毒培养物滴度间无显著性差异,χ2检验返回相关性的P值均大于0.95。结论第1～第3代细胞培养风疹病毒与第0代相比,可获得相同滴度的病毒培养物,p3代兔肾细胞应用于疫苗生产可显著提高细胞及病毒产量。     

SARS冠状病毒感染恒河猴的病毒、血清学检测研究

[目的]对感染SARS-CoV的恒河猴进行病毒、血清学等指标检测及研究,确定模型动物成功感染,并为SARS发病机制,疫苗评价,药物筛选确定参考指标。[方法]SARSCo-V经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。[结果]用巢式RT-PCR在感染后每天提取的咽拭子标本中检测SARS-CoV的RNA,以细胞培养冠状病毒为阳性对照,以正常恒河猴咽拭子为阴性对照,在8只动物病毒接种第5天开始可检测到大小为797bp的目的条带,阳性检出最长可持续到第15天。进一步用病毒分离实验对PCR结果进行确证,8只动物中的5只恒河猴接种5天的咽拭子标本中,经Vero细胞培养,细胞产生了典型细胞病变(CPE),提示SARS冠状病毒能感染恒河猴并有病毒的复制和排毒。IFA方法证实为SRAS-CoV抗原存在。SARS-CoV感染恒河猴后,可以检测出免疫反应。在SARS冠状病毒接种前和接种后第5、8、11、15、19、23、26、30、34、每隔4-7天以及安乐死时采血,制备血清测定抗体,8只恒河猴接种病毒前均血清中SARS冠状病毒特异性抗体IgG为阴性,10天后安乐处死的5只感染猴在11-15天开始,至安乐死时,均为阳性。IgG阳性的5只恒河猴均有一定的中和抗体产生,且对SARS病毒感染细胞有一定的保护性。感染SARS病毒猴后与正常猴比较,其细胞杀伤效应明显增强。感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

恒河猴大脑皮质星形胶质细胞的原代培养及鉴定

为建立有效纯度高的恒河猴星形胶质细胞体外培养体系,无菌条件下取6月龄恒河猴婴猴的大脑皮质,除去白质,充分剪碎后机械吹打制成细胞悬液接种培养,待原代培养的细胞长满培养皿后,通过恒温摇床振荡和传代差速贴壁除去寡突胶质细胞、成纤维细胞等,得到纯化后的星形胶质细胞,并用GFAP-FITC(glial fibrillary acidic protein-fluorescein isothiocyanate)免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。分离培养的细胞具备典型的星形胶质细胞形态,并表达星形胶质细胞特异性抗原GFAP(glial fibrillary acidic protein),纯化后获得了高纯度的恒河猴星形胶质细胞。采用该培养方法成功建立原代恒河猴星形胶质细胞培养体系,为体外研究嗜神经性病毒、神经系统疾病及其相关中枢神经病理机制等提供了可靠的细胞模型。     

甲肝病毒在猴胚肾功能和Vero细胞上的分离与适应

使用恒河猴胚肾（MEK）细胞从临床标本中分离和适应了甲肝病毒W和X,通过阻断实验、中和实验、免疫荧光和免疫电镜实验、RT－PCR对其进行特异性鉴定,证明了甲肝病毒。W株和X株第7代在MEK细胞上的抗原滴度分别为1：512、1：1024,感染滴度（logTCID50/mL）分别为8．17、8．50,只有分离株W可以适应于Vero细胞,第6代21d抗原滴度为1：256,感染滴度（logTCID50/mL）为8．00。     

Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5′端非编码区变异关系

脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)是一类无包膜单股正链RNA病毒,基因组长约7．5kb。其5′端非编码区由约742个核苷酸长,主要与病毒RNA复制、蛋白翻译起始、病毒颗粒的装配及病毒的细胞适应减毒及神经毒力密切相关。我们研究发现,脊髓灰质炎病毒(Sabin株)在人胚肺二倍体细胞(KME17)上致细胞病变较猴肾细胞慢,病毒产量亦明显低于恒河猴肾细胞培养,国内外也有类似的报道。     

流行性乙型脑炎病毒的变異III．通过地鼠腎细胞后对小白鼠及恒河猴的毒力和免疫力

1．乙型脑炎病毒SA14毒株通过地鼠腎单层细刚胞连续传递20代后,对小白鼠的脑内毒力发生显著变异,由原来的10-5—10-6下降至10-1—10-2.5／0．03ml之间,与地鼠腎细胞的釉胞致病变毒力(TCID50)此鞍,二者相差4．00—5．07log,而皮下,肤腔毒力则巳丧失。 2．变异株对恒河猴的脑腔致病力亦有明显的减弱,以大量病毒脑腔感染猴子后,虽有脑炎症状出现,但发病溉伏期和病程均有延长,而感染的4只猴子中仅有一只死亡。 3．变异株对小白鼠具有较强的免疫力作用,在豚鼠、猴手及小白鼠体内均能产生一定的特异性中和抗体。     

人胎肾和人胎肺细胞对肠道病毒的易感性

猴肾细咆和人羊膜细胞虽然对大多数类型的肠道病毒易感,但由于猴肾细胞来源有限和人羊膜细胞制备的成功率较低,昕以需要寻求其他更合适的细胞来代替。为了确定人胎肾和人胎啼细胞在肠道病毒工作中的使用价值,本文较系统地比较了这两种细胞对晒遒病毒的易感性。实验证明,除了Co～ckie B2和H4型病毒,ECHO 9、18、20和2 7型病毒在人胎肾细胞及ECHO、22和23型病毒在人胎肺细胞的滴度不够理想外,这两种细胞对所研究的其余类型的病毒都较易感。大多数类型的肠道病毒不但能在人胎肾和人胎肺细胞中培养和传代,而且原有皿凝者仍能保持其血凝特性。用猴肾、人胎肾和人胎肺细胞从122份粪便标本分离病毒,结果共有64份标本阳性。其中用猴肾细胞分离得到阳性结果的有;4份,用人胎肾细胞有56份,用人胎肺细胞有51份。猴肾细胞对脊髓灰质炎病毒比人胎肾和人胎肺细胞易感,而人胎肾和人胎肺细胞对某些非脊髓灰质炎病毒比猴肾细胞易感。实验结果表明,在肠道病毒的工作中可以应用这两种细胞培养来代替猴肾细胞培养。     

SARS冠状病毒分离培养和鉴定的实验研究

建立严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒分离、培养方法,为SARS冠状病毒动物模型的建立提供实验依据,并根据病毒在体内存活的时间确定检测指标。选用已鉴定为SARS冠状病毒的毒株,经过鼻腔接种感染恒河猴。定期采集咽拭子标本,分离血清或血浆,用Vero细胞进行病毒培养、分离。结果显示,在SARS冠状病毒感染恒河猴后2、5、7天,可以从拭子中分离到病毒,5～15天可在猴肺、脾、肝、肾和淋巴组织中分离到病毒,并用免疫荧光法和RT-PCR方法进行了确定。首次实验证实了SARS冠状病毒可在恒河猴体内复制。SARS病毒的成功分离是SARS冠状病毒动物模型建立的主要依据,在进行疫苗安全性和药效评价等工作中,病毒分离可作为药物筛选、疫苗评价的重要指标。     

应用细胞工厂建立人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺

目的为提高生产效率、增加原代地鼠肾细胞单产量及狂犬病病毒产量,建立人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）连续培养多次收获工艺。方法选用12-14日龄SPF地鼠,无菌取肾经消化,制备成细胞悬液,分装到40层细胞工厂并培养细胞成单层;接种狂犬病病毒固定毒aG株,连续培养病毒并多次收获。分别对同一细胞批制备的多个单次病毒收获液的免疫原性、病毒滴度和地鼠肾细胞蛋白质含量进行检测。结果用40层细胞工厂培养原代地鼠肾细胞和狂犬病病毒,细胞接种浓度为1．0×10。～1．5x10。cells／mL,（36±1）℃培养72h成致密单层;按0．1MOI病毒接种,可进行6次收获病毒;多个单次病毒收获液病毒滴度均不低于6．0lgLD50／mL;免疫原性检查保护指数不低于100;地鼠肾细胞蛋白质残留量随着收获次数的增加而不断降低。结论用细胞工厂建立了人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺,能显著提高地鼠。肾单产量,增加产能。     

恒河猴(Macaca mulatta)肾细胞冻存复苏培养及其生物学特性的研究

本文使用深低温(-196℃)冻结保存动物细胞技术,对胰酶分散的恒河猴肾细胞的冻存,复苏培养及其生物学特性进行了研究。结果表明、液氮冻存2—58周的恒河猴肾细胞,其平均存活率为63.3—74.4％。复苏培养细胞于6—7天形成緻密单层,对脊髓灰质炎病毒敏感;国产二甲基亚砜可以用作冻存细胞的保护剂;复苏培养的细胞核型正常;其生物学特性与未冻的原代细胞一致。     

流行性乙型脑炎强毒株和弱毒疫苗株SA14-14-2对猴子和小鼠的致病性和病理学研究

为了解乙型脑炎 (乙脑 )减毒活疫苗弱毒株SA14 14 2神经毒力的减弱程度 ,本文对弱毒株及其原株SA14强毒株进行了猴体和小白鼠的致病性和病理学变化的比较试验。SA14强毒株病毒 (原始滴度 6 15× 10 8/ml) ,以10 -2 和 10 -4 ～ 10 -7不同稀释度于丘脑两侧合并脊髓注射恒河猴 ,每组除 10 -4 1只外其余均为 2只。另以 10 -4 和10 -6～ 10 -8不同稀释度脑内注射小鼠 ,每组 8只。结果猴子除 10 -4 1只外其余全部发病死亡 ,小鼠则全部死亡。SA14 14 2以 1∶5稀释病毒 (原始滴度为 8× 10 6/ml)按同样方法注射 4只猴和 30只小鼠 ,结果全部存活。另以SA1410 -2 病毒皮下注射 3只猴未死亡 ,而以 10 -1皮下注射 30只小鼠时则全部死亡。SA14 14 2以 1∶5稀释病毒皮下注射小鼠时则全部存活。病理组织学结果显示二种动物接种SA14株强毒后主要表现为弥散性脑脊髓炎 ,以神经细胞坏死为其主要特征和最突出的病变。猴子的病变以脊髓前角、丘脑和中脑黑质为重 ,小鼠的病变则以大脑皮质、海马部最重 ,脊髓的病变却比脑轻。接种弱毒株的动物则仅有轻微炎症反应、神经细胞坏死极少出现。以上结果表明以脑内接种时恒河猴和小鼠对乙脑病毒均高度敏感 ,以皮下接种时小鼠的敏感性高于猴子。乙脑SA14 14 2弱毒株的神经毒力包括致     

影响腺病毒凝集血球特性的某些因素

本文报告采用人胚肾细胞制备的腺病毒血凝素,就不同个体猴血球、不同血球浓度、不同培养温度、不同pH对腺病毒血凝滴度的影响进行的研究。结果表明,3、7、11、1{、21型腺病毒血凝滴度不仅受不同个体猴血球影响,(其中以3、7、1 4型病毒显著),同样也受不同血球浓度、培养温度、不同pH液体影响。进行腺病毒血凝反应的适宜条件为：选用对腺病毒敏感的猴血球,1％红细胞悬液、用1／50 M pH 7.6—8．0PBS作稀释液、37℃培养1小时。人胚肾细胞和HcLa细胞均可用于制备腺病毒血凝素,在人胚肾细胞上制备腺病毒血凝素时采用103—105ICID50病毒感染细胞,受染细胞在染毒后3—5天出现完全病变,产生的血凝素滴度高,午型血凝素滴度高于3型。     

流行性出血热病毒在MA-104和Vero-E6传代细胞上繁殖动态的比较

用流行性出血热病毒(陈株)分別感染MA-104和Vero-E6传代细胞,结果受病毒感染的MA-104细胞荧光阴性细胞出现早,感染滴度高,胞浆内颗粒大,提示MA-104细胞用于该病毒的分离传代及抗原片的制作等方面优于Vero-E6细胞。流行性出血热病毒(EHFV)在某些原代及传代细胞上能适应增殖,国内外已有过报导。但用对轮状病毒十分敏感的恒河猴胚肾MA-104细胞培养和增殖EHFV并与通常使用分离该病毒的VeroE6细胞进行繁殖动态观察,尚未有过报导。本文用间接免疫荧光法(IFA)比较观察EHFV在两种细胞上的增殖动态,为MA-104细胞代替常规Vero-E6细胞用于该病毒的分离、传代等研究以及抗原片的制备提供依据。     

不同狂犬病毒株在地鼠肾细胞上培养的病毒滴度与免疫原性比较

三个狂犬病毒株,分别经地鼠肾细胞培养,将其抗原含量,病毒滴度和免疫原性进行比较。结果显示,三个病毒株的抗原含量有差异。但差异显著性,CTN-V10M3的毒力最高,CTN-BHK3的毒力最低,aG株的毒力虽然居中,但免疫原性最好,它仍是最适于地鼠肾细胞上培养的毒株。     

用细胞培养分离人轮状病毒

<正>过去许多人试图用细胞培养繁殖高效价的轮状病毒都告失败了。最近,Wyatt等曾将人工适应2型人轮状病毒(Wa株)经既定菌丛的新生小猪传11代后,在非洲绿猴原代细胞培养中得到相当高的效价。本研究中用MA104细胞(一种恒河猴胚肾的细胞系)分离培养,得到三株人轮状病毒。     

麻疹疫苗生产用毒株沪191增殖的动力学研究

通过延长麻疹病毒生产中感染的基质细胞培养时间并连续收获病毒,获得麻疹病毒生产的动力学曲线;通过工艺放大阶段的病毒增殖动力学研究,提高麻疹病毒产量。采用直接接种和间接接种法,接种不同感染量(MOI)的病毒,将转瓶培养单次收获改为转瓶培养多次收获,滴定整个培养期间每次收获液的病毒滴度,观察感染的细胞培养维持状况并计算病毒产量。结果表明,直接接种病毒培养期为20~25d,共收获病毒14~17次;间接接种病毒培养期24d,共收获病毒29次。通过延长感染细胞培养时间和连续收获病毒,获得病毒繁殖的动力学曲线。通过麻疹毒株的增殖动力学研究获得了麻疹疫苗生产毒株沪191增殖动力学相关参数。     

SARS-CoV中和抗体保护恒河猴等感染SARS-CoV研究

[目的]阐明SARS病毒感染后能否再次感染,疫苗产生的抗体中长期保护效果,被动免疫是否真正安全有效等,为防治SARS提供实验依据。[方法]实验分4组,分别为一组(SARS恒河猴恢复组):用感染SARS-CoV发病12月后的4只恒河猴,均有中和抗体产生。二组(SARS食蟹猴恢复组):用感染SARS-CoV发病12月后的3只食蟹猴,均有中和抗体产生。三组(SARS血清输入恒河猴组):3只恒河猴,病毒接种时中和抗体阴性。病毒接种两天后输入抗体阳性血清(恒河猴血清,感染获得,效价为:1:128),用量10ml/只,分别经肌肉和静脉输入,各5ml。四组(恒河猴SARS-CoV感染组):2只恒河猴,病毒接种时中和抗体阴性。SARSCo-V经鼻腔接种,在感染的第1天开始到7天安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和中和抗体测定。[结果]一组(SARS恒河猴恢复组):接种SARS-CoV后未见发热等异常临床表现。血清生化无ALT、LDH、CK、总蛋白和血清白蛋白异常。3只猴在接种病毒后的咽拭子中,RT-PCR分别未检出、第1天检出、第1-3天中检出病毒。第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。2只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎。二组(SARS食蟹猴恢复组):接种3只未见任何不良临床表现,血清生化5项正常。3只猴在接种病毒后的咽拭子标本中,RT-PCR分别未检出SARS病毒、在第1-2天检出、在第1-3天中检出病毒。第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。3只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎等。三组(SARS血清输入恒河猴组):3只恒河猴在病毒接种的第2-5天时有一过性的体温升高,3940℃。血清生化5项正常。3只猴在接种病毒后的咽拭子标本中,RT-PCR分别在第1-3、第1-4天和第1-2天检出SARS病毒。2只猴第7天咽拭子中病毒分离阳性。另外1只在第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。3只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎等。四组(SARS恒河猴SARS-CoV感染组):2只猴病毒接种后,第2-4天时有一过性的体温升高,3940℃。2只进行接种病毒后1-7天安乐死时,RT-PCR在恒河猴的咽拭子标本中连续检出SARS病毒。在第2、5天咽拭子中、7天安乐死时肺组织中病毒分离阳性。2只猴肺等组织病理学检查发现肺组织表面局部有轻度发灰实变现象,可见到间质性肺炎病变,内皮细胞受损,出血和水肿。大多数肺泡没有完整的内衬细胞残留,肺泡间隔变宽并被以吞噬细胞为主的单核炎症细胞浸润,同SARS肺炎改变。实验表明,前期感染产生中和抗体的恒河猴、食蟹猴再次感染病毒,和模型对照猴比较,动物肺组织等只出现轻微或无病理变化,RT-PCR检出时间大大缩短,病毒培养未能分离出病毒,所有这些指标,均证实中和抗体有明显的保护作用,是有效的。被动免疫从结果来看,有一定的作用,但保护作用弱。     

麻疹病毒

<正>分类学 根据病毒分类学国际委员会(ICVT)的推荐,麻疹病毒属于麻疹病毒属(分类),它与副粘液病毒属及肝炎病毒属一起组成副粘液病毒科。 麻疹病毒的分馏与纯化 病毒在猴细胞(早期恒河猴肾培养基,Vero,CV—1,BSC—1及其它传代细胞系)或人细胞(原代人胚肾组织培养,HEp—2及其它传代细胞系)的单层细胞中于72～96小时内繁殖,旋转组织培养法同样亦可以使用。病毒培养物须经低速离心澄清,然后将     

轮状病毒新敏感细胞的筛选

轮状病毒（RV）的细胞培养问题的尚未完全解决,其原因之一可能与敏感细胞较少有关。为此,我们进行了RV新敏感细胞的筛选,发现恒河猴胚肾传代细胞Frhk-4感染不同血清型的人和动物RV标准株Wa、DS－1、YO、ST－3、SA－11和UK,37℃旋转或静止培养均能产生明显CPE。培养物经ELISA测定含RV抗原,用PAGE检测有特征性RV核酸图型,电镜超萍切片检查感染细胞可见RV颗粒,证实Rrhk-4是RV的敏感细胞,这在国内外尚未见报道。同时与MA104－CV－1细胞的比较研究证明,三种细胞对Wa和DS－1的敏感性及增殖滴度,以CV－1最高,Frhk-4次之,MA－104最低。     

脊髓灰质炎减毒活疫苗III型新毒种的研究I．Iil型新毒株中III2的选育

我们在“独立自主、自力更生”的方针指引下,取材我国儿童中分离出的III型野毒株,采用快速传代方法减毒,在不同温度下(30℃、32℃、3 4℃、3 6℃)通过猴肾细胞传代26次,毒力有明显减低,又经3次蚀斑纯化,选育出3株减毒变异株,其中以III：株经各项检定证明符合毒种要求,特别是猴子的嗜神经毒力程度很低,为我国脊髓灰质炎III型活疫苗的生产提供了新的毒株。