米尔顿姬小蜂线粒体16SrRNA与COI基因片段序列测定及分析

【背景】米尔顿姬小蜂是一种入侵我国台湾地区的植食性小蜂,能够严重影响水果的产量和食用价值。目前在我国大陆没有分布,由于其个体微小,与近似种区别较小,通过传统的形态学分类方法难以鉴定,因此有必要研究其基因片段序列,探讨分子鉴定方法。【方法】利用PCR方法扩增并测定了米尔顿姬小蜂线粒体16SrRNA和COI基因的部分序列,并对各序列的碱基组成进行了分析。然后根据COI基因部分序列,利用DNAMAN的MaximumLikelihood方法构建了米尔顿姬小蜂与膜翅目其他科的系统发育树。【结果】16SrRNA基因的PCR扩增产物为426bp,COI基因的PCR扩增产物为488bp。通过测序获得米尔顿姬小蜂16SrRNA和COI基因部分序列,序列分析表明,16SrRNA和COI基因的A＋T含量均较高,存在较强的A＋T偏向性。系统发育树显示,米尔顿姬小蜂与蚜小蜂科的Encarsiaberlesei亲缘关系最近,与姬小蜂科的Chrysocharisnautius、C．eurynota亲缘关系较远。【结论与意义】本研究为米尔顿姬小蜂的分子鉴定提供了依据。     

基于ITS条形码序列的刺桐姬小蜂分子鉴定

【目的】刺桐姬小蜂Quadrastichus erythrinae Kim体型小,传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。【方法】本研究测定了刺桐姬小蜂的rDNA ITS1和ITS2序列,根据18S rDNA部分序列,利用MEGA的最大相似法(Maximum Likehood)构建系统发育树。根据刺桐姬小蜂ITS1和ITS2序列设计了特异引物,应用特异引物对单只刺桐姬小蜂进行PCR扩增,可稳定地扩增出明显的目的DNA条带。【结果】研究表明,基于ITS基因的DNA条形码技术可以用于刺桐姬小蜂的快速准确鉴定。【结论】因此,采用ITS1和ITS2区的特异性引物可对刺桐姬小蜂进行快速分子鉴定。     

米尔顿姬小蜂rDNA ITS1和ITS2的序列分析及其分子鉴定

本研究测定了米尔顿姬小蜂Anselmella miltoni Girault的rDNA ITS1和ITS2序列,以探讨其分子鉴定方法。米尔顿姬小蜂的ITS1和ITS2侧翼区（18S和5.8S）序列相对稳定,ITS1和ITS2序列存在种间差异。根据18S rDNA部分序列,利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法构建了与膜翅目其它科的系统发育树。根据米尔顿姬小蜂ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,扩增效果理想,采用上述特异性引物可从单头米尔顿姬小蜂稳定地扩增出明显的目的DNA条带。因此,可以采用ITS1和ITS2区的特异性对米尔顿姬小蜂进行快速的分子鉴定。     

中国新发现芙新姬小蜂孤雌产雌品系的分子鉴定及其内共生菌Rickettsia的检测

【目的】芙新姬小蜂Neochrysocharis formosa(Westwood)是世界上蔬菜潜叶蝇的优势寄生蜂。2015年6月,我们在北京发现该寄生蜂存在孤雌产雌品系(thelytokous strain),为在中国首次发现。由于芙新姬小蜂孤雌产雌品系和两性品系(arrhenotokous strain)难于从形态上进行区分,本研究旨在从分子水平对这两种品系进行鉴定,为孤雌产雌品系的后续研究和应用奠定基础。【方法】以芙新姬小蜂孤雌产雌品系TH-China和两性品系AR-China的室内饲养种群为研究对象,分别扩增芙新姬小蜂两种品系的核糖体基因(28S rDNA和ITS-1基因)和线粒体COⅠ基因序列,比较两种品系的遗传分化;采用Rickettsia特异性引物NforRick1/NforRick2扩增其16S rDNA,克隆测序并进行BLAST比对;检测在TH-China卵巢管、幼虫、蛹和成虫,以及AR-China成虫中是否含有诱导形成孤雌产雌特性的内共生菌Rickettsia。【结果】分别以引物LCO1490/HCO2198和COⅠ1/COⅠ2扩增的两段COⅠ基因序列为分子标记建立的系统发育树表明,芙新姬小蜂两种品系分别聚为2个分支,品系间的遗传距离分别为0.039和0.023;以ITS-1基因为分子标记时,两种品系间有21个差异位点,遗传距离为0.008;以28S rDNA为分子标记时,两种品系间无差异位点。从TH-China的Rickettsia中扩增的16S rDNA序列与日本报道的芙新姬小蜂孤雌产雌品系内共生菌Rickettsia sp.的16S rDNA序列(Gen Bank登录号:AB185963)100%一致。芙新姬小蜂TH-China卵巢管、幼虫、蛹和成虫中均含有Rickettsia,而AR-China成虫不含Rickettsia,推测Rickettsia是孤雌产雌特性的形成原因。【结论】线粒体COⅠ基因可将芙新姬小蜂孤雌产雌品系和两性品系分为2个明显的遗传支系,而核糖体基因28S rDNA和ITS-1基因在两种品系间没有遗传分化或不能形成2个遗传分化支系。     

周氏啮小蜂非典型气味受体基因的cDNA序列及进化分析

【目的】对重大林业害虫美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)的重要寄生性天敌周氏啮小蜂Chouioia cunea Yang(膜翅目:姬小蜂科)一个Or83b直同源基因的cDNA全长序列CcOr1进行多角度的进化分析,为研究周氏啮小蜂嗅觉分子机制奠定基础。【方法】通过转录组测序的方法鉴定CcOr1基因全长,并对该基因进行序列及进化分析。【结果】该基因长度为1 428 bp,编码475个氨基酸;蛋白二级结构预测具脊椎动物G蛋白典型的七跨膜结构域。【结论】该基因较为保守,主要接受负选择压力。作为寄主广泛的寄生蜂,周氏啮小蜂与寄主单一的类群相比,其同义突变率较低,密码子偏好性较高。     

四种散白蚁的分子鉴定及系统发育地位(等翅目:鼻白蚁科)

【目的】目前对白蚁的物种鉴定主要依赖形态学特征,本文从分子水平对4种散白蚁进行了鉴定和系统发育分析。【方法】对4种散白蚁(湖南散白蚁Reticulitermes hunanensis Tsai et Peng、平额散白蚁Reticulitermes planifrons Li et Ping、近暗散白蚁Reticulitermes perilucifugus Ping和侏儒散白蚁Reticulitermes minuts Ping et Xu)的线粒体16Sr DNA和COⅡ基因序列进行扩增和测序,对序列进行比对及碱基组成分析后上传至GeneBank,并构建系统发育树对4种散白蚁进行系统发育分析。【结果】16S rDNA和COⅡ基因片段长度分别约380bp和720bp,两个基因的AT碱基含量均远远大于GC,16S rDNA序列的遗传距离普遍大于COⅡ序列,且两者的系统发育情况不一致。【结论】COⅡ基因系统发育与地理位置差距相关较为明显,16S rDNA基因序列碱基差异较COⅡ多,推断COⅡ基因更适合于白蚁由于地理位置引起的系统发育和地理迁徙及传入情况的研究,16S rDNA基因更适合于白蚁种类的鉴别。     

墨天牛属昆虫COⅠ基因比较及系统学初步研究

【目的】对11种墨天牛线粒体DNA细胞色素氧化酶C亚基Ⅰ基因(COⅠ)进行比较并对墨天牛属系统发育关系进行初步探讨。【方法】本文测定分析了11种墨天牛线粒体DNA细胞色素氧化酶C亚基Ⅰ基因(COⅠ),并采用简约法和贝叶斯推论法构建了墨天牛属的分子进化树。【结果】序列比对分析得到470 bp大小的COⅠ基因片段,其中可变异位点169个(36.0%),保守位点301个(64.0%),转换/颠换的平均值(R值)为1.03,说明此段序列适合于分子进化树。利用不同系统发育重建方法得到的进化树具有相似的拓扑结构,同时结合形态学分类特征对墨天牛属昆虫的分子系统进化关系进行探讨。结果显示分子结果与形态分类结果相似。【结论】利用COⅠ基因构建的墨天牛属系统发育树是探讨墨天牛分类的有效方法。     

16S rRNA和recA、groEL基因分类鉴定乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的比较

【目的】比较16S rRNA和recA、groEL基因部分序列用于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种分类鉴定的效果。【方法】对已鉴定的8株分离自传统发酵乳的乳酸乳球菌, 选取recA和groEL基因片段, 通过PCR扩增、测序, 将测序得到的序列比对后构建系统发育树, 并与16S rRNA基因序列分析技术进行比较。【结果】比较分析不同菌株16S rRNA和recA、groEL基因的亲缘关系, recA、groEL基因可以准确地完成乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的区分和鉴定。【结论】recA和groEL基因序列分析可以实现乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的区分, 因其具有快速、准确、稳定的特点, 可适合于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种间的快速分类鉴定。     

基于线粒体16S rDNA和COⅡ基因的三种高等白蚁分子鉴定与系统发育研究

【目的】本文从分子水平对双工土白蚁Odontotermes dimorphus Li et Xiao、中华钩扭白蚁Pseudocapritermes sinensis Ping et Xu、商城奇象白蚁Mironasutitermes shangchengensis Wang et Li 3种白蚁科高等白蚁进行鉴定和系统发育分析。【方法】利用PCR方法对上述3种高等白蚁线粒体16S r DNA和Cytochrome oxidaseⅡ(COⅡ)基因进行扩增、测序,经比对和碱基分析后上传至Gene Bank,并在数据库中选取白蚁相应基因进行遗传距离和差异碱基数目计算及系统发育研究。【结果】16S r DNA和COⅡ基因片段长度分别约385 bp和720 bp,两个基因的AT碱基含量均远远大于GC,16S r DNA基因与3种高等白蚁遗传距离和差异碱基数目最少的是0.102和35,COⅡ基因为0.024和16,由16S r DNA和COⅡ两个基因构建的的系统发育树不一致,COⅡ基因构建的系统发育树比16S r DNA基因更符合科、属的关系。【结论】通过16S r DNA和COⅡ基因序列均可将上述3种高等白蚁与其它白蚁区别开,COⅡ基因比16S r DNA基因更适合研究白蚁的系统发育研究,与3种白蚁亲缘关系最近的分别是黑翅土白蚁Odontotermes formosanus、台湾华扭白蚁Sinocapritermes mushae和高山象白蚁Nasutitermes takasagoensis。     

基于线粒体COⅠ和Cytb基因序列研究粉蝶科七属间的系统发生关系

【目的】为了探讨粉蝶科Pieridae 7属的系统进化关系。【方法】基于线粒体COⅠ(609 bp)和Cytb(393 bp)基因部分序列,以眼蝶科的2个物种为外类群,运用UPGMA和ME法重建分子系统树。【结果】联合基因构建的分子系统树显示:外群牧女珍眼蝶Coenonympha amaryllis(Cramer)和阿芬眼蝶Aphantopus hyperantu(Linnaeus)构成一独立支系,可以作为外群;云粉蝶属和粉蝶属姊妹关系构成一分支,亲缘关系较近;襟粉蝶属与钩粉蝶属形成姐妹关系,亲缘关系较近。【结论】成功重建了粉蝶科7属的系统进化关系。     

基于线粒体基因的东方蜜蜂群体亚分化研究

【目的】进一步了解我国境内东方蜜蜂Apis cerana(Fabricius)群体的亚分化状况,为保护和合理利用这一宝贵的蜂种资源提供理论依据。【方法】采用公开的两对引物对中国境内19个地区的东方蜜蜂线粒体tRNAIle~ND2与16S rRNA基因的部分序列进行了扩增、测序,并与其他地区东方蜜蜂的相应序列进行了比对分析。【结果】扩增获得的tRNAIle~ND2基因的部分序列长度为471~474 bp,序列中共13个变异位点;16S rRNA基因的部分序列长度为581~585 bp,序列中共6个变异位点。ND2基因部分蛋白比对结果显示,仅山西沁源东方蜜蜂有一个位点发生变异。【结论】基于两基因部分序列所构建的系统发育树表明,海南东方蜜蜂明显区别于其他地区的东方蜜蜂;阿坝地区的东方蜜蜂可能属于高海拔地区的一种生态型,未支持其单独作为一个亚种的结论;吉林3个地区的东方蜜蜂之间亲缘关系较近,可能属于一个生态型;云南东方蜜蜂的变异比较丰富。     

基于18S基因序列的姬小蜂分子系统发育

本文基于18S rDNA部分序列,用MP和Baysian方法研究了姬小蜂科的系统发育,对姬小蜂科的单系性及其与其它小蜂科间的关系进行了讨论。姬小蜂亚科、灿姬小蜂亚科和啮姬小蜂亚科形成三个独立的支系,研究结果支持它们各自的单系性,但本结果没有明确姬小蜂科的单系性。研究结果同时还支持瑟姬小蜂族、扁股姬小蜂族和狭面姬小蜂族三个族的地位,但不支持姬小蜂族的地位。姬小蜂科的单系性及其与其它小蜂间的关系还需更多的形态学数据和更多的基因序列来进一步研究[动物学报52 (2) : 288 -301 , 2006]。     

青海湖裸鲤舌状绦虫裂头蚴的分子鉴定及系统发育研究

通过PCR方法扩增了青海湖裸鲤体腔寄生舌状绦虫18S rRNA、COⅠ和COB基因部分序列, 并进行分子鉴定, 分析了3种基因的同源性, 利用这3种基因进行分子进化和系统发育研究。结果显示, 经过分子鉴定, “面条样”绦虫为肠舌状绦虫, 克隆的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列分别与AF254121(中国)、AF153910(中国)和JQ279109(阿尔及利亚)的核苷酸序列同源性为100.00%、99.49%和93.32%。同时, 利用GenBank中其他种属绦虫的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列构建系统发育树, 均与已鉴定的肠舌状绦虫聚在同一支上, 且与肠舌状绦虫中国广州分离株种属亲缘关系较近, 与其他绦虫所属分支相距较远。初步阐明了鉴定的肠舌状绦虫分离株与其他种属之间的系统发育关系。     

大黄鱼16SrRNA和18SrRNA基因的测定与序列分析

利用多对引物,扩增并测定出大黄鱼16SrRNA基因和18SrRNA基因的部分序列,其长度分别为1202bp和1275bp,16SrRNA基因序列的GC含量为46．12％,18SrRNA基因的Gc含量为53．oo％。将大黄鱼16SrRNA基因序列与GenBank中15种硬骨鱼类的同源序列结合,同时将其18SrRNA基因序列与GenBank中9种脊索动物的同源序列相结合,运用软件获得各自序列间差异百分比,转换和颠换数值等信息。基于这两种基因序列,利用NJ法和BI法,分别构建16种硬骨鱼类和10种脊索动物的分子系统树。18SrRNA构建的系统树包括三大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的1个物种,另一支为2种硬骨鱼类。16SrRNA构建的系统树显示大黄鱼所在的石首鱼科与鲈科和盖刺鱼科亲缘关系较近。此外还讨论了这两个基因的序列特征。     

通用引物双重PCR在节肢动物物种鉴定中的应用

【目的】本研究旨在使用基于线粒体基因通用引物的双重PCR技术同时扩增单一样本中两条标记基因,从而达到简化节肢动物物种鉴定流程的目的。【方法】在一次PCR实验中同时加入可扩增线粒体COI基因和16S rDNA两个不同分子标记的引物,对3纲8目14科的14种节肢动物物种标本的基因组DNA进行扩增;扩增产物经电泳和胶回收后测序,并BLAST在线搜索相似序列,验证基于通用引物的双重PCR在不同的动物类群中用于物种鉴定的有效性。【结果】应用基于COI和16S rDNA的引物从分属于3纲8目14科的14种节肢动物基因组DNA中均可成功扩增目的基因;扩增产物测序结果进一步证实了扩增的准确性。【结论】通过本方法进行物种的分子鉴定,不仅可以保证物种鉴定的高准确率,还可以明显减少时间与DNA样本量的消耗,这对需要快速准确鉴定物种或珍稀的材料样本十分重要。     

基于线粒体COⅠ基因的三江源草原毛虫金小蜂分子鉴定与系统发育分析

【目的】三江源草原毛虫金小蜂在形态学水平上已被鉴定为草原毛虫蛹期的寄生蜂新种。本研究拟从分子标记水平再次对三江源草原毛虫金小蜂进行物种辅助鉴定,探究其在小蜂总科中的系统发育关系。【方法】利用分子生物学手段对三江源草原毛虫金小蜂线粒体COⅠ基因进行扩增、测序与分析,并采用邻接法构建系统发育N-J树。【结果】三江源草原毛虫金小蜂线粒体COⅠ基因校正后的长度为812 bp,A、T、C、G碱基含量分别为34.36%、42.61%、10.59%、12.44%,AT含量显著高于GC含量,具有明显的AT偏好性;三江源草原毛虫金小蜂与蝶蛹金小蜂COⅠ基因相似度最高,遗传距离最小,表明三江源草原毛虫金小蜂与蝶蛹金小蜂亲缘较近,因此推断三江源草原毛虫金小蜂可能属于金小蜂科物种;三江源草原毛虫金小蜂先后与Eupelmus sp.、Sycoscapter sp.、Idiomacromerus sp.、Diaziella bizarre、Eurytoma sp. 聚为一支,且与 Idiomacromerus sp.+(Diaziella bizarre+Eurytoma sp.)+(Eupelmus sp.+Sycoscapter sp.)形成姊妹群。【结论】本研究从分子标记水平揭示了三江源草原毛虫金小蜂与金小蜂科物种的亲缘关系较近,支持了三江源草原毛虫金小蜂的形态学物种鉴定结果,为更深入地研究三江源草原毛虫金小蜂系统发育提供了科学依据,对草原毛虫的生物防治具有重要意义。     

美洲斑潜蝇SS PCR检测技术研究

【背景】美洲斑潜蝇是一种严重威胁瓜果蔬菜、烟草、棉花等经济作物和花卉生产的入侵性害虫。由于潜叶蝇类害虫体型较小、生活方式隐蔽、形态相似,本文针对其难以快速准确地进行形态鉴别的问题,以美洲斑潜蝇为研究对象,以菜田常见的4种潜叶蝇类害虫为参照,采用种特异性PCR方法（species specific PCR, SS PCR）,研究其快速分子检测鉴定技术。【方法】调用GenBank中一段936 bp的美洲斑潜蝇线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因（CO[KG-*2]Ⅰ）的序列（GenBank登录号为EU219613）,并根据此基因片段的碱基序列设计引物1对,其扩增片段大小为294 bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对美洲斑潜蝇的CO[KG-*2]Ⅰ基因具有扩增能力,对其他种类如南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇等没有扩增能力。该引物不仅对成虫具有良好的扩增效果,对蛹、幼虫以及单粒卵也具有同样的扩增效果,其最低检出阈值为1/3840头成虫。【结论与意义】SS PCR技术体系可用于美洲斑潜蝇的鉴定识别与检测监测,对阻止其进一步扩散蔓延具有重要意义。     

美洲斑潜蝇SS-PCR检测技术研究

【背景】美洲斑潜蝇是一种严重威胁瓜果蔬菜、烟草、棉花等经济作物和花卉生产的入侵性害虫。由于潜叶蝇类害虫体型较小、生活方式隐蔽、形态相似,本文针对其难以快速准确地进行形态鉴别的问题,以美洲斑潜蝇为研究对象,以菜田常见的4种潜叶蝇类害虫为参照,采用种特异性PCR方法（species-specific PCR,SS-PCR）,研究其快速分子检测鉴定技术。【方法】调用GenBank中一段936bp的美洲斑潜蝇线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因（COⅠ）的序列（Gen-Bank登录号为EU219613）,并根据此基因片段的碱基序列设计引物1对,其扩增片段大小为294bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对美洲斑潜蝇的COⅠ基因具有扩增能力,对其他种类如南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇等没有扩增能力。该引物不仅对成虫具有良好的扩增效果,对蛹、幼虫以及单粒卵也具有同样的扩增效果,其最低检出阈值为1/3840头成虫。【结论与意义】SS-PCR技术体系可用于美洲斑潜蝇的鉴定识别与检测监测,对阻止其进一步扩散蔓延具有重要意义。     

我国新入侵外来害虫美洲棘蓟马的外部形态和分子鉴定

美洲棘蓟马Echinothrips americanus Morgan, 1913是新入侵我国的种类。本文报道了该虫各发育阶段的外部形态和分子鉴定结果。首先利用体视显微镜对美洲棘蓟马不同虫态的外部形态进行了观察和拍照;再选择线粒体COⅠ基因中一段约430 bp的序列进行PCR扩增和测序,将所得序列用于蓟马种类的分子鉴定。使用不同的矩阵和系统发育构建方法对待鉴定的蓟马以及另外38种蓟马进行了聚类分析,结果表明：基于线粒体COⅠ基因第1和2编码位点,利用NJ法构建的系统发育树可以较好地区别不同蓟马种类,可作为调查我国蓟马种类和分布的快速方便方法。最后对美洲棘蓟马的基本生物学特性和防控对策进行了综述。     

基于线粒体COI基因探讨鹟亚科部分属和种的分类地位

采用PCR扩增、测序的方法,对鹟亚科(Muscicapinae)6属16种鸟类的线粒体COI基因序列1176bp进行测定,并以荒漠伯劳和发冠卷尾作为外群构建Bayes、ML、MP3棵系统发育树。结果支持:寿带属(Terpsiphone)、扇尾鹟属(Rhipidura)、方尾鹟属(Culicicapa)3属与鹟亚科其他鸟类亲缘关系较远,扇尾鹟属与方尾鹟属亲缘关系较近;鹟属(Muscicapa)为单系发生,本研究结果未能确定它与仙鹟属、姬鹟属的进化关系;铜蓝鹟(Muscicapa thalassina)从鹟属中移出,归入仙鹟属。上述结论解决了鹟亚科部分属间的进化关系,为鹟亚科分类系统的研究提供了分子水平证据。