冷冻前后人红细胞膜蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

冷冻保存红细胞在血液保存工作中是一项新技术。以甘油为冷冻保护剂,加入新鲜红细胞中,在-80℃冷冻保存,可达到长期保存的目的,为了检验在血液保存过程中红细胞的质量,国外也曾对血库内保存的枸椽酸、枸椽酸钠、葡萄糖(简称ACD)全血中红细胞膜上蛋白质组分的改变情况进行研究。例如1969年布莱纳(Brener)等曾用淀粉凝胶电泳分析新鲜红细胞膜蛋白与保存一定时间后红细胞膜蛋白;1971年穆尔(Moore)对常规方法保存的全血,红细胞膜上蛋白质改变情况进行分析。本文使用硫酸十二醋钠盐(SDS)聚丙烯酰胺凝膜电泳分析冷冻前后红细胞膜蛋白,通过了解红细胞膜改变情况,进一步证明冷冻保存后红细胞结构完整,并肯定了其保存价值。     

卤虫脱壳卵的液氮冷冻保存研究

作者以甘油、ＤＭＳＯ、葡萄糖和蔗糖为冷冻保护剂对卤虫脱壳卵进行了液氮冷冻保存研究．各保护剂对短期吸水发育的胚胎有一定的冷冻保护作用,在本实验条件范围内,高浓度保护剂较低浓度保护剂好,双重保护剂（甘油＋ＤＭＳＯ、葡萄糖＋蔗糖）冷冻保护作用较单一保护剂效果好。饱和ＮａＣｌ溶液对各发育时期的胚胎均有较好的冷冻保护作用,但对后期胚胎的冷冻保护作用较弱。作者认为胚胎内冰晶的形成是卤虫脱壳卵冷冻致死的主要原因。冷冻保护剂对卤虫脱壳卵的冷冻保护作用可能与它们的脱水作用有关。     

两种冷冻保护剂和冷冻程序对兔精子冷冻效果的比较

目的比较不同冷冻保护剂和冷冻程序对兔精子冷冻保护的影响,以期提高兔精子冷冻保存的效果和效率。方法用三步降温法（程序Ⅰ）和两步降温法（程序Ⅱ）两种冷冻程序与终浓度分别为2%,3%,4%,5%的甘油和乙酰胺两种冷冻保护剂配合进行精液冷冻保存,统计精子复苏率。结果使用程序Ⅱ添加3%乙酰胺的冷冻保护剂实验组的精子复苏率较高,同其它组比较差异有显著性意义（P〈0.05）;程序Ⅱ比程序Ⅰ节省约70%的时间,同种浓度冷冻保护剂的不同冷冻程序组之间精子复苏率差异无显著性意义（P〉0.05）。结论程序Ⅱ与3%乙酰胺配合可以取得良好的冷冻保存效果;用程序Ⅱ进行兔精液冷冻保存可以大幅缩短操作时间。     

四种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎渗透性和毒性作用的比较

作为胚胎冷冻保存的基础性研究,冷冻保护剂的渗透性和毒性研究非常重要.本试验选用1,2-丙二醇、甘油、乙二醇和二甲基亚砜4种常用冷冻保护剂,对小鼠2-细胞胚胎进行渗透性和毒性研究.结果显示:1.5 mol/L的1,2-丙二醇、乙二醇和二甲基亚砜冷冻保护剂对2-细胞胚胎的渗透性显著高于甘油保护剂;4种冷冻保护剂对细胞膜的完整性没有影响;1.5 mol/L的乙二醇、1,2-丙二醇和甘油保护剂处理后的2-细胞胚胎的囊胚发育率和孵化率与对照组胚胎比较差异不显著(P>0.05),但显著高于二甲基亚砜处理后的2-细胞囊胚发育率和孵化率(P<0.01).结果表明:在4种冷冻保护剂中,乙二醇和1,2-丙二醇适合于小鼠2-细胞胚胎冷冻保存     

猪精液冷冻保存影响因素的研究进展及展望

由于在经济生产中的重要意义,猪精液冷冻保存技术成为研究的焦点。早期的研究多集中在对冷冻保护剂和冷冻方法的筛选与优化上,为猪精液冷冻保存进行了深入的探索。但研究表明,无论采用何种冷冻保护剂、何种冷冻方法都损害了精子的受精能力,并伴随有蛋白质的丢失、表达量的改变、功能活性的增减等,这种研究现状迫使该领域的研究向充分揭示冷冻对精子损伤的机理方向转移,希望通过揭示冷冻保存所导致的蛋白质结构和功能改变的实质,充分阐明冷冻损伤的机理,为猪精液冷冻保存提供理论依据,并最终促进猪精液冷冻保存技术的快速发展。     

冷冻保护剂及预冷时间对河蟹精子体外冷冻保存的影响

本文以甘油、二甲亚砜（DMSO）为冷冻保护剂,采用两步降温法,以精子存活率和DNA损伤程度为检验其冷冻效果的评价指标,研究了冷冻保护剂和预冷时间对河蟹Eriocheir sinensis精子冷冻保存效果的影响。胰蛋白酶消化法获得河蟹游离精子,液氮冷冻保存8h以上,精子保存密度为10^7个／mL,伊红染色法检测精子存活率,单细胞凝胶电泳（SCGE）检测精子DNA损伤。实验共设置10个组,分别为不同浓度的单一冷冻保护剂（每种保护剂的体积百分比分别为5％、10％、12．5％、15％）和两种保护剂组合（两种保护剂在同一实验组巾的体积百分比含量均为5％、10％）。结果显示,12．5％甘油的保存效果最佳,精子存活率达到62．60％。在此基础上,以10％甘油作为冷冻保护剂,设置5、10、20、30、40min5个时间梯度,研究了预冷时间对精子冷冻保存效果的影响。结果显示预冷时间的长短对精子冷冻保存效果的影响显著,当预冷时间低于20min时,精子大量死亡,且精子DNA严重损伤;当预玲时间超过30min时,精子存活率明显提高,精子DNA损伤明显减弱。     

猪精液冷冻影响因素的研究进展

由于在经济生产中的重要意义,猪精液冷冻保存技术已成为研究的焦点。文章综述了国内外猪精液冷冻技术的研究成果,主要阐述精液的冷冻保存原理,并从冷冻稀释液和冷冻保护剂、冷冻方法和解冻方法等方面阐述了猪精液冷冻的影响因素。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展

配子冷冻保存技术在动物繁殖育种中具有重要的意义,但猪卵母细胞的冷冻保存目前还很困难,主要表现为冻后继续发育能力低。这与影响卵母细胞玻璃化冷冻效果因素众多有关,如脂滴的存在使猪卵母细胞对冷冻非常敏感。冷冻保护剂的使用同时也产生了毒性作用。针对猪卵母细胞冷冻保存的特点,研究人员已研究出了一些新的方法来提高冷冻效果,如细胞骨架稳定剂的使用减少了冷冻对猪卵母细胞造成的损伤,通过改进冷冻载体提高了冷冻速率,从而提高了冷冻效果。     

深低温冷冻技术的研究进展

细胞及组织的深低温保存有较高的临床应用和研究价值,在冷冻保存技术中两个关键领域首先发展的是冷冻控制率。冷冻保护剂能增加溶液粘性,提高冷冻速率从而保护细胞及组织免受冷冻损伤。对最佳冷冻保护剂的研究为保存临床应用的组织工程产品提供了理论依据。而玻璃化冷冻近年来越来越受到人们的关注,玻璃化冷冻技术具有冷冻速度快、冻融损伤小,操作简单等优点,能够提高复苏后的存活率。本文对深低温保护剂的组成、分类、应用及冷冻保存的重大进展和障碍进行了综述。     

不同冷冻保护剂对早期卵裂期小鼠胚胎冷冻后成活率和发育的影响

为了评价利用不同冷冻保护剂冷冻早期卵裂期胚胎的效果,用小鼠为实验动物,采用慢速冷冻、快速融解的冷冻技术,比较丙二醇、二甲基亚砜和甘油作冷冻保护剂对小鼠2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎冷冻后胚胎存活率和囊胚形成率的影响。发现以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂冷冻4-细胞、8-细胞胚胎,解冻后胚胎成活率和囊胚形成率显著高于以二甲基亚砜或甘油为冷冻保护剂。结果表明,丙二醇是一种冷冻早期卵裂期小鼠胚胎有效的冷冻保护剂。     

两种不同冻存保护剂对细胞冻存效果的比较

为比较甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂对同一种细胞冷冻保存的效果,通过甘油和二甲基亚砜分别与血清、基础培养基的不同配比,进而比较二者对肿瘤细胞的冻存效果,并且分别探索出二者哪种用于细胞冻存效果更好和各自最佳冻存效果的比例。本文研究成果将为细胞冻存提供更明确的冻存方法。     

影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的因素

从屠宰场收集具有高遗传价值的卵母细胞进行冷冻保存,生产可移植胚胎,这为补充宝贵的种质资源以及物种遗传改良提供机会。虽然玻璃化冷冻技术已经成功保存了几种动物的卵母细胞,但由于卵母细胞对低温极其敏感,导致其进展十分缓慢。本文主要综述了卵母细胞脂质含量、卵丘细胞层、冷冻卵母细胞阶段、冷冻保护剂等因素对哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响,为改善卵母细胞冷冻效果指引方向。     

去甲基万古霉素菌种低温冷冻、冷干保藏条件优化及10 年菌种保藏效果

【目的】针对去甲基万古霉素产生菌不耐保藏的问题,改进菌种保藏方法,对超低温液氮保藏、-80°C低温冷冻保藏、冷干保藏方法跟踪考察10年保藏稳定性,评价不同保藏方法对去甲基万古霉素产生菌的保藏适用性。【方法】采用甘油作基础保护剂进行超低温液氮保藏和-80°C低温冷冻保藏,采用脱脂牛奶作基础保护剂进行冷干保藏,针对超低温液氮保藏进行降温速率考察,研究非渗透性冷冻保护剂海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等对3种保藏方法的冻存影响,对优选出的保藏方法进行10年跟踪考察。【结果】3种保藏方法冻后菌种存活率依次为:-80°C低温冷冻保藏超低温液氮保藏冷干保藏。液氮保藏最适降温速率为快速冷冻。优选出最佳保护剂配方:超低温液氮保藏为甘油8.0%,海藻糖3.5%;-80°C低温冷冻保藏为甘油6.0%,PVP 5.0%;冷干保藏为脱脂牛奶,6.0%海藻糖。采用优化保藏条件,液氮保藏10年存活率稳定在70.6%,菌种发酵水平为入藏水平的92.9%。【结论】在优化条件下,尤以超低温液氮保藏适合于去甲基万古霉素产生菌长期保藏。     

酒酒球菌液氮超低温保存

【目地】为安全、长期的保藏酒酒球菌,本文研究了菌体生长时间、冷冻方法、解冻温度、菌密度以及保护剂等对酒酒球菌细胞冷冻存活率的影响,找到最优液氮超低温保存方法。【方法】采用平板计数法测定冷冻存活率。【结果】实验结果表明酒酒球菌的最佳保存方法为:首先在稳定期前期离心收集菌体;其次加入保护剂(20 g/L酵母浸提物,40V/V甘油,20 g/L蔗糖,30 g/L谷氨酸钠)稀释菌体,使菌密度为109CFU/mL;然后直接投入液氮冷冻;最后在37℃温水浴中迅速解冻。保存6个月后,其中21株酒酒球菌的冷冻存活率达到99%以上。【结论】初步研究表明酵母浸提物,甘油,蔗糖,谷氨酸钠复合保护剂对酒酒球菌的保护效果较好,液氮超低温保存可用于酒酒球菌的长期保存。     

仙客来愈伤组织的超低温保存

为了避免连续继代造成仙客来愈伤组织的变异, 对仙客来愈伤组织进行了超低温冷冻保存研究。以继代后处于对数生长期的愈伤组织为实验材料, 首先在含有不同蔗糖浓度的培养基上预培养不同时间, 转至不同的冰冻保护剂中直接液氮冷冻或-20oC预冷冻2 h, 然后液氮超冷冻保存, 37oC水浴迅速解冻, 并用相应蔗糖浓度的液体培养基洗涤, 以中性红染色测定细胞的存活率, SPSS13.0软件进行统计学分析。结果表明: 预培养基中蔗糖浓度、预培养时间、降温方式、冷冻保护剂等对解冻后材料相对存活率存在不同程度的影响, 筛选出4%蔗糖浓度预培养3 d、9号保护剂、0oC停留30 min后直接冷冻为超低温保存的最佳方案, 通过简单的方法获得了较好的愈伤组织保存效果。     

仙客来愈伤组织的超低温保存

为了避免连续继代造成仙客来愈伤组织的变异, 对仙客来愈伤组织进行了超低温冷冻保存研究。以继代后处于对数生长期的愈伤组织为实验材料, 首先在含有不同蔗糖浓度的培养基上预培养不同时间, 转至不同的冰冻保护剂中直接液氮冷冻或-20oC预冷冻2 h, 然后液氮超冷冻保存, 37oC水浴迅速解冻, 并用相应蔗糖浓度的液体培养基洗涤, 以中性红染色测定细胞的存活率, SPSS13.0软件进行统计学分析。结果表明: 预培养基中蔗糖浓度、预培养时间、降温方式、冷冻保护剂等对解冻后材料相对存活率存在不同程度的影响, 筛选出4%蔗糖浓度预培养3 d、9号保护剂、0oC停留30 min后直接冷冻为超低温保存的最佳方案, 通过简单的方法获得了较好的愈伤组织保存效果。     

滇南小耳猪精液的直接冷冻保存

目的建立滇南小耳猪精液冷冻保存方法,加速云南省特有小型猪种的小型化选育。方法利用脉冲电刺激模式诱导公猪输精管自助收缩排精。利用直接冷冻新技术（DFM）研究不同冷冻方案对精子的运动度、精子顶体完整性和体内授精胚胎发育能力的影响。结果在直接冷冻方法中,3%甘油防冻剂的作用下,60 s植冰时间和1.5 mm/s的冷冻降温参数对精子运动度保护良好,精子运动复苏率达到61.7%。但是,3%乙二醇虽然与甘油一样对精子的顶体完整性都有很好的保护作用,对精子运动度保护能力较差。此外,3%甘油、60 s植冰、1.5mm/s冷冻速度的直接冷冻的冻精解冻,移植到超数排卵的母猪子宫颈口实施人工授精,获得卵的受精和胚胎发育潜能尚可。结论玻璃管直接冷冻可以完成滇南小耳猪精子的冷冻保存。     

非人灵长类动物精子冻存技术的研究进展

随着生物医学技术的发展,应用非人灵长类动物模型进行基础科学研究日益广泛。与此同时,由于栖息地破坏、狩猎和基因隔离,许多非人灵长类动物濒临灭绝。因此,改进非人灵长类动物精子冻存技术对物种遗传资源的保藏具有重要的意义。本文概述了非人灵长类动物的精液特征,介绍了精液液化和冷冻精子质量评估的方法,分析了冷冻保护剂、冷冻稀释液及冷冻方法等因素对精子冻存效果的影响,总结了目前非人灵长类精子冷冻常用的冷冻保存液和冷冻方法,并对相关精子参数进行了比较,同时探讨了非人灵长类动物精子冻存研究面临的困境,并提出了可行的方案。总之,本文综述了近年来非人灵长类动物精子冻存的重要研究成果,对开发新的冷冻保护剂及改进冷冻技术具有一定的参考价值。     

小鼠睾丸组织慢速冷冻保存工艺的优化研究

目的 冷冻保存睾丸组织用于后期移植,是除精子冻存以外保持男性生育力的另一有效途径。本文对块状睾丸组织常用的慢速冷冻降温程序进行了改进。方法 通过缩短保护剂加载时间、提高第一阶段的冷却速率、第二阶段直接投入液氮等方法对小鼠睾丸组织进行冷冻保存。在不同温度对小鼠睾丸组织冻存体系进行诱导冰晶成核并冻存,降低睾丸组织慢速冷冻保存所需保护剂浓度。结果 改进的两步法冻后组织内生殖细胞的凋亡阴性率均较高,其中精原细胞98.4%、精母细胞99.2%、精子细胞88.4%、支持细胞98.1%,显著高于常用慢速冷冻组,与对照组均无显著性差异。相比于未置核组, -10℃置核可显著提高5% DMSO保护剂慢速冷冻保存的冻后效果,生殖细胞的凋亡阴性率为精原细胞82.9%、精子细胞92.1%、精母细胞93.2%及支持细胞88.9%,与较高浓度保护剂10% DMSO组冻存结果无显著性差异,说明置核能够降低所需保护剂的浓度,降低毒性损伤。结论 本研究通过改进两步法和置核提高了小鼠睾丸组织冻后的质量,为临床上人睾丸组织的冻存提供参考。     

一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法

Silwet L-77是一种非离子型的表面活性剂,常用于植物的转化。本研究发现,Silwet L-77的加入也可以显著地提高大肠杆菌的转化效率。同时,我们比较了不同培养温度、不同培养浓度(OD_(600)值)及不同冷冻保护剂对感受态细胞转化效率的影响。我们发现,28℃培养E.coli至OD_(600)值为0.55~0.6之间时制备感受态细胞,利用9%的DMSO做为冷冻保护剂冷冻保存感受态细胞,转化时加入0.001 5%~0.002%的Silwet L-77,可以获得最高的转化效率。总之,该研究进一步优化了大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法。