PP2A-A/在金鱼及斑马鱼发育中的分化表达模式

以金鱼和斑马鱼为研究对象,运用RT-PCR和Western Blot技术分析蛋白磷酸酶2A(PP2A)结构亚基A(PP2A-A/)在金鱼、斑马鱼成体9种组织和12个发育时期胚胎中mRNA和蛋白水平的表达情况,得到其分化表达模式为:(1)在mRNA水平上,PP2A-A/在金鱼、斑马鱼9种组织中具有较强表达;种属差异性和组织差异性均较大;结构亚基A的两亚型A和A的表达存在差异。(2)在蛋白水平上,PP2A-A/在金鱼、斑马鱼9种组织中均有表达;种属差异性不大但出现明显的组织差异性。(3)PP2A-A/mRNA在金鱼和斑马鱼卵裂期到囊胚期胚胎中大量存在,PP2A-AmRNA在金鱼眼色素期量剧增推测其对金鱼眼色素的形成至关重要。(4)PP2A-A/基因在金鱼、斑马鱼12个发育时期胚胎中均有较高水平的蛋白存在,提示其为维持胚胎的正常发育发挥重要作用。       

斑马鱼HO1基因的表达特征及功能研究

实验对血红素加氧酶1（HO1）在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示,斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%86.8%,血红素结合标签相似性为87.5%95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测,结果显示HO1转录本母源存在,HO1 mRNA的表达水平在尾芽期前较低,到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。HO1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,HO1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现,注射HO1 mRNA使HO1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射HO1 MO使HO1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。HO1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被HO1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,HO1基因表达抑制可导致IGF1表达量显著下降,IGFBP1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼HO1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。       

斑马鱼 HO1 基因的表达特征及功能研究简

实验对血红素加氧酶1(HO1)在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示,斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%—86.8%,血红素结合标签相似性为87.5%—95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测,结果显示HO1转录本母源存在,HO1mRNA的表达水平在尾芽期前较低,到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。HO1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,HO1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现,注射HO1 mRNA使HO1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射HO1 MO使HO1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。HO1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被HO1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,HO1基因表达抑制可导致IGF1表达量显著下降,IGFBP1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼HO1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。     

Connexin43基因抑制对斑马鱼心血管系统发育的影响

为了研究cx43基因抑制对斑马鱼胚胎心血管系统发育的影响,针对cx43的翻译起始位点设计两个吗啉修饰的反义寡核苷酸抑制其表达,在斑弓鱼受精卵一到两细胞期混合注射并且验证其有效性.注射后用原位杂交和原位免疫荧光检测心脏标志基因的表达以及心脏的表型,同时利用显微荧光造影和原位杂交检测血管的发育情况.用心室心房的标志基因vmhc和amhc反义RNA探针进行的原位杂交结果显示,vmhc表达抑制,而amhc表达上调.原位免疫荧光显示与原位杂交一致的结果表明:心房扩张心室缩小,并且心脏环化不全.用血管标志基凶flk-1的RNA探针原位杂交和显微荧光造影表明,cx43基因抑制的斑马鱼胚胎血管无明显缺陷.此外,cx43基因抑制的斑马鱼胚胎心脏功能也有明显改变,包括心脏搏动无力,有血液回流现象.抑制cx43的表达可能通过影响两个细胞群的迁移导致斑马鱼胚胎心脏的发育缺陷,从而影响了心脏的功能,但是未发现胚胎血管系统发育的明显缺陷.     

金鱼Dishevelled3基因的克隆与分化表达研究

目的:本文主要以金鱼中的dvl-3基因为研究对象,研究dvl-3在金鱼不同的组织和胚胎发育时期中可能行使的功能。方法:采用RACE克隆技术获得金鱼dvl-3基因的c DNA全长,再利用半定量RT-PCR技术和蛋白免疫印记(Western blot)技术分析研究dvl-3基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达差异。结果:在金鱼不同组织与胚胎发育时期,dvl-3基因在mRNA水平和蛋白水平上具有显著的表达差异性。结论:由此可见散乱蛋白dvl-3在金鱼不同的组织和胚胎发育时期中可能行使不同的功能,但其具体的功能及机制还有待进一步研究。     

Cx43基因在人类及小鼠胎心发育中的时空表达规律

目的　检测Cx4 3在人类和小鼠的胚胎心脏的表达 ,了解该基因在心脏发育过程中的表达规律。方法　选取人类 6～ 18孕周正常胚胎或胎儿心脏 6 3例 ,小鼠孕龄 9 5～ 16 5d胚胎心脏 6 4例 ,采用免疫组化法显示Cx4 3基因在心脏的表达。结果　早期人类胚胎心脏中 ,Cx4 3在心室肌中没有表达 ,心房肌表达微弱 ,原始小梁网中表达很高 ,随着胚胎发育 ,在心房和心室的表达逐渐增强 ,小梁网的表达在胚胎 13～ 14周达到高峰。室间隔的肌部表达量较弱 ,膜部室间隔不表达。房室瓣和大动脉根部管壁Cx4 3没有明显表达。除了在大动脉管壁表达不同 ,小鼠胚胎心脏表达规律与人类基本相同。结论　Cx4 3对于胚胎心脏的发育至关重要。     

斑马鱼胚胎发育过程中TGF-1基因的表达特征分析

为研究转化生长因子 (Transforming growth factor , TGF)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用, 通过NCBI获得TGF-1基因序列, TGF-1 cDNA全长1571 bp, 编码377个氨基酸。系统进化树分析发现, TGF-蛋白按照不同的类型严格聚类, 斑马鱼TGF-1与其他鱼类的TGF-1聚集到一个分支, 在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示, TGF-1基因为母源表达基因, 在分节期之前的表达水平比较低, 而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现, TGF-1基因在斑马鱼24 hpf 胚胎中开始有特异信号出现, TGF-1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处, 表明TGF-1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎, 发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现, 低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明, TGF-1基因参与斑马鱼胚胎发育调控, 并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-1基因的功能奠定基础。       

整体原位杂交法初步研究MMP11b在斑马鱼胚胎发育过程中的表达

克隆斑马鱼基质金属蛋白酶11b（MMP11b）基因,并研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达状况。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的MMP11b RNA探针,采用全胚胎原位杂交方法研究MMP11b基因在斑马鱼胚胎的表达。MMP11b基因在胚胎受精后一个细胞时期就开始表达,并且一直持续到96h,从受精后24h起,在耳囊处表达明显,在受精后48h时期在胸鳍和肛门处也有特异性表达。MMP11b在斑马鱼胚胎发育不同时期表达明显,且在耳囊处有持续表达。     

Cx43 与Smo 基因在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的:研究细胞间隙连接蛋白43(Cx43)与信号通路基因Smoothened(Smo)在胰腺癌中的表达及其临床意义。方法:选择从2013年1月~2015年12月在医院接受手术治疗的胰腺癌患者53例切除组织及与癌组织相配对的3cm外癌旁组织,对比不同胰腺组织中Cx43与Smo阳性表达率,及Cx43 m RNA与Smo m RNA表达水平,分析胰腺癌组织中Cx43和Smo表达与胰腺癌的病理特征之间的关系及两者的相关性。结果:胰腺癌组织中Cx43的阳性表达率及Cx43 m RNA表达水平明显低于在癌旁组织,而Smo的阳性表达率及Smo m RNA表达水平明显高于癌旁组织,差异均有统计学意义(均P0.05)。胰腺癌患者组织学分级为Ⅲ级、有淋巴结转移者的Cx43 m RNA表达水平分别明显低于Ⅰ~Ⅱ级、无淋巴结转移者,Smo m RNA表达水平则明显高于Ⅰ~Ⅱ级、无淋巴结转移者,差异均有统计学意义(均P0.05)。Pearson相关性分析结果发现,胰腺癌组织中Cx43 m RNA和Smo m RNA表达呈负相关关系(r=-0.846,P=0.000)。结论:Cx43 m RNA在胰腺癌中的表达下降,而Smo m RNA则表达上调,临床监测Cx43及Smo基因的表达情况,有助于评价患者的病情与预后。     

斑马鱼整体原位杂交法研究MMP15a的发育相关表达的初步观察

克隆斑马鱼基质金属蛋白酶15a（MMP15a）基因,并研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达状况。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的MMP15a RNA探针,采用全胚胎原位杂交方法研究MMP15a基因在胚胎斑马鱼的表达。结果MMP15a基因在胚胎受精后一个细胞时期就开始表达,从受精后24h起,在眼睛处表达明显,从受精后48h MMP15a在胸鳍和耳囊有特异性表达至到受精后96h。MMP15a在斑马鱼胚胎发育不同时期表达明显,且在胸鳍和耳囊处有持续表达。