LPS诱导肝细胞LO2释放HMGB1蛋白的研究

以人单核巨噬细胞系U937细胞为对照,探讨肝细胞LO2分泌晚期炎症介质高迁移率族蛋白HMGB1过程的特点.400 μg/L LPS作用于人U937细胞和LO2细胞,MTT和荧光TUNNEL结果显示0～24 h,两种细胞均未见明显坏死和凋亡.RT-PCR结果表明LO2细胞HMGb1 mRNA表达水平高于相应对照组的时相(20 h)晚于U937细胞(16 h).Western blOT显示LO2细胞上清中检测到HMGB1蛋白的时相(16 h)晚于U937细胞(8h);两者上清HMGB1蛋白水平呈时间依赖性,但U937细胞分泌HMGB1蛋白的量占有绝对优势.细胞免疫荧光观察到两者均有HMGB1从细胞核向胞浆移位的现象,但LO2细胞晚于U937细胞.由此可见,LPS诱导肝细胞分泌晚期炎症介质HMGB1具有时相晚、量少的特点,且其分泌HMGB1的过程与HMGB1蛋白移位有关,而并不依赖于细胞坏死与凋亡.     

LPS诱导肝细胞L02释放HMGB1蛋白的研究

以人单核巨噬细胞系U937细胞为对照,探讨肝细胞L02分泌晚期炎症介质高迁移率族蛋白HMGB1过程的特点.400μg/L LPS作用于人U937细胞和L02细胞,MTT和荧光TUNEL结果显示0～24 h,两种细胞均未见明显坏死和凋亡.RT-PCR结果表明L02细胞HMGB1 mRNA表达水平高于相应对照组的时相(20 h)晚于U937细胞(16 h).Western blot显示L02细胞上清中检测到HMGB1蛋白的时相(16 h)晚于U937细胞(8h);两者上清HMGBl蛋白水平呈时间依赖性,但U937细胞分泌HMGB1蛋白的量占有绝对优势.细胞免疫荧光观察到两者均有HMGB1从细胞核向胞浆移位的现象,但L02细胞晚于U937细胞.由此可见,LPS诱导肝细胞分泌晚期炎症介质HMGB1具有时相晚、量少的特点,且其分泌HMGB1的过程与HMGB1蛋白移位有关,而并不依赖于细胞坏死与凋亡.     

阻断Kv1.3通道可增强RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能

本研究旨在阐明电压门控性钾通道1.3(Kv1.3)在巨噬细胞吞噬功能中的作用.利用RAW264.7巨噬细胞吞噬鸡红细胞的半定量检测系统及吞噬异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌(E.coli)k-12的流式细胞术定量检测系统测定巨噬细胞的吞噬功能.研究发现,用海葵神经毒素(Sh K)(100 pmol/L)选择性阻断Kv1.3通道能显著增强处于静息状态的和被脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力;Sh K也可增强静息RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的能力,但由于LPS刺激吞噬的效应近乎饱和,Sh K并不能进一步增加被LPS激活的RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的数量.Sh K促进LPS激活的RAW264.7细胞释放一氧化氮(NO),但并不增加静息RAW264.7细胞的NO释放.Sh K(100 pmol/L)自身并不影响静息RAW264.7细胞释放细胞因子,但能抑制LPS激活的RAW264.7细胞释放白细胞介素-1?.Sh K(100 pmol/L)对RAW264.7细胞的活力无明显影响.RAW264.7细胞表达Kv1.3通道蛋白;LPS使RAW264.7细胞的Kv1.3蛋白表达下调,菲律宾菌素Ⅲ(小凹蛋白依赖性内吞途径抑制剂)使Kv1.3蛋白表达上调,细胞松弛素D对Kv1.3蛋白表达无明显影响.研究表明,RAW264.7细胞表达Kv1.3蛋白;阻断Kv1.3通道可增强RAW264.7细胞的吞噬能力和NO生成.结果提示,Kv1.3通道可能是RAW264.7细胞吞噬活动的负调节因子,有可能成为治疗巨噬细胞吞噬功能异常相关疾病的一个靶点.     

IFITM3在脓毒症模型及胆碱能抗炎模型中的表达

目的:探讨干扰素诱导的跨膜转运蛋白3(IFITM3)在LPS刺激的RAW264.7细胞系的脓毒症模型中的表达以及胆碱能抗炎模型中的表达。方法:用1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞24、48、72 h后,用Western-Blot法检测各组细胞IFITM3蛋白表达水平。用1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞后,给予50μM胆碱能受体激动剂GTS-21以及同时给予100 n M胆碱能受体拮抗剂α-BGT刺激细胞24 h后,用Western-Blot法检测各组细胞IFITM3蛋白表达水平。用ELISA法检测IL-1β的方法验证脓毒症模型和胆碱能抗炎模型的建立。结果:(1)1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞后,IFITM3蛋白表达明显降低(P0.01)。(2)1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞后再给予50μM GTS-21,IFITM3蛋白表达明显升高(P0.001);而给予100 nMα-BGT后,IFITM3蛋白表达明显降低(P0.001)。结论:LPS刺激的RAW264.7细胞IFITM3蛋白表达降低。给予胆碱能激动剂GTS-21后能够逆转LPS诱导的IFITM3表达的降低,给予胆碱能受体拮抗剂α-BGT则能阻断这种现象。IFITM3有可能在脓毒症中发挥保护作用,并且参与了胆碱能抗炎通路抗炎过程的调节。     

人羊膜上皮细胞对脂多糖刺激下的RAW264.7 细胞向M1 极化的预防作 用及其初步作用机制

目的:本实验探讨人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,h AECs)预防RAW264.7细胞在脂多糖(LPS)刺激后向M1极化的作用以及可能机制。方法:采用流式细胞仪检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,ELISA检测细胞释放NO浓度,Real-time PCR检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、精氨酸酶1(arginase-1,Agr-1)及甘露糖受体(mannose receptor,MR又称CD206)等基因表达情况,Western blotting检测RAW264.7胞质蛋白p-IκBα以及胞核蛋白NF-κB的表达。结果:RAW264.7培养基组与h AECs条件培养基干预组的凋亡率分别为5.68%±2.3%、6.68%±2.1%(p0.05)。LPS刺激组与h AECs条件培养基干预组两组的迁移率分别为42.03±0.07%、14.71±0.04%(p0.05);LPS刺激组与h AECs干预组两组NO释放量分别为27.73±10μM、13.33±6.43μM(p0.05);Real Time-PCR结果显示,h AECs干预组M1型巨噬细胞相关基因如IL-1β、TNF-α、iNOS以及INF-β的表达显著下调,M2型巨噬细胞相关基因如Arg-1、CD206、CD36等表达上调(p0.01)。Western blotting结果显示,hAECs干预组RAW264.7中胞质蛋白p-IκBа以及胞核蛋白NF-κB的蛋白含量降低。结论:h AECs与RAW264.7预培养能有效预防LPS刺激下RAW264.7向M1极化,其机制可能是通过抑制IκBα蛋白磷酸化来降低核内NF-κB的含量,从而抑制了M1型相关基因的表达。     

黄芪甲苷Ⅳ对内毒素诱导RAW264.7细胞损伤的保护作用及机制研究

目的:研究黄芪皂苷Ⅳ对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7损伤的保护作用及机制.方法:测定细胞活力判断心肌细胞损伤的程度.TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10的释放以及NF-кB蛋白、Akt和磷酸化Akt表达用以研究作用机制.结果:黄芪皂苷Ⅳ对LPS引起的RAW264.7细胞损伤具有显著的抑制作用,1,3和10μM黄芪皂苷Ⅳ可显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α,IL-1β和IL-6的生成,促进IL-10的释放.黄芪皂苷Ⅳ剂量依赖性地增加了由LPS刺激而引起的RAW264.7细胞NF-kB蛋白的表达,抑制了LPS所致的p-Akt蛋白表达的升高.结论:黄芪皂苷Ⅳ可通过Akt-NF-kB途径调控促炎因子和抗炎因子表达的失衡,有效发挥对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7损伤的保护作用.     

太子参多糖对RAW 264.7巨噬细胞免疫调节作用的初步研究

目的:探讨不同浓度太子参多糖(PHPs)对RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞的免疫调节作用。方法:以不加任何样品的培养基为空白对照组,以脂多糖(LPS)为阳性对照组,同时用多粘菌素B(PMB)来排除LPS对PHPs的污染。当PHPs作用巨噬细胞RAW264.7 24 h后,通过研究PHPs对巨噬细胞释放NO及细胞因子TNF-a生成的影响来评价太子参多糖的免疫调节作用。结果:太子参多糖具有较明显的促进巨噬细胞释放NO的作用,可显著增加TNF-α的释放。结论:太子参多糖对RAW264.7小鼠单核巨噬细胞具有潜在的免疫调节活性。     

A族链球菌诱导巨噬细胞坏死而非凋亡

为了研究A族链球菌(GAS)作用巨噬细胞系RAW264.7后,RAW264.7细胞增殖变化的情况,以进一步研究GAS的致病机制。将RAW264.7接种于96孔板,采用低菌量、中菌量和高菌量分别作用于该细胞,培养三天后行MTT检测;用TUNEL及ANNEXIN V-FITC法检测高菌量GAS作用后巨噬细胞是否发生凋亡;透射电子显微镜观察低、中、高菌量GAS作用RAW264.7后细胞超微结构的变化。结果显示低、中菌量GAS对RAW264.7细胞增殖有促进作用;高菌量GAS对细胞增殖有抑制作用,且高菌量GAS作用RAW264.7后诱导大部分细胞发生了坏死而非凋亡。结果表明高菌量GAS引起RAW264.7细胞发生坏死而非凋亡。     

nAChRα1调控尼古丁促进巨噬细胞RAW264.7增殖迁移的作用研究

目的:探讨nAChRα1是否参与调节尼古丁促进巨噬细胞RAW264.7增殖迁移的作用。方法:将体外培养的RAW264.7细胞分4组为:(1)正常对照组;(2)尼古丁组;(3)对照干扰+尼古丁组;(4)nAChRα1干扰+尼古丁组。用尼古丁(5 ng/mL)刺激巨噬细胞RAW264.7,特异性nAChRα1 si RNA用脂质体3000转染细胞,CCK-8法检测尼古丁处理3 h、24 h和48 h后细胞的增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Western blot和RT-PCR检测细胞内nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA的表达情况。结果:与空白对照组相比,尼古丁可显著促进RAW264.7细胞的增殖和迁移,增加nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表达;而在干扰nAChRα1表达后,尼古丁诱导的RAW264.7细胞的增殖和迁移明显被抑制,且细胞nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表达均显著的降低。结论:nAChRα1可介导尼古丁促进RAW264.7细胞的增殖和迁移,这可能与其参与调控尼古丁增加RAW264.7细胞分泌MMP-2、MMP-9有关。     

EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白表达的调节

目的:探讨EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白表达的调节,为EGb761的临床运用提供可行的依据。方法:LPS(1μg/m L)诱导不同时间后,western blotting检测THP-1细胞上清液中HMGB1蛋白含量变化及不同浓度EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白的表达和NF-κB的活性;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。共聚焦显微镜观察EGb761对LPS诱导THP-1细胞释放HMGB1蛋白核转位变化。结果:(1)LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α的含量在刺激6-12 h后明显高于空白对照组,而EGb761+LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均显著低于LPS组(P0.05)。(2)EGb761处理LPS诱导THP-1细胞6 h后细胞上清液NF-κB活性表达量较空白对照组低,随着处理时间延长至12 h,NF-κB的活性表达量呈明显下降趋势(P0.05)。(3)LPS诱导THP-1细胞18 h后,细胞上清液中HMGB1蛋白含量呈明显升高趋势(P0.05)。(4)不同浓度EGb761对LPS诱导THP-1细胞18 h后,HMGB1蛋白含量较空白对照组有下降趋势,HMGB1蛋白含量随着EGB761浓度增加至100μg/m L呈下降趋势并呈浓度依赖效应(P0.05)。(5)LPS诱导THP-1细胞后,在共聚焦显微镜下可见胞浆中大量HMGB1蛋白标记分布,而EGb761+LPS共同诱导THP-1细胞后胞浆中可见少量HMGB1蛋白分布。结论:LPS可诱导THP-1细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达增多及NF-κB活化,导致HMGB1蛋白表达增多及核转位,而EGB761能抑制THP-1细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达及NF-κB活化,调节HMGB1蛋白的表达及核转位。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.