Thermococcus sp.B1001环糊精酶的重组表达及在麦芽七糖制备中的应用

成功构建pET-24a-tscd质粒,实现Thermococcus sp.Strain B1001来源的环糊精酶(TsCDase)在Es-cherichia coli BL21(DE3)中表达.通过热处理和镍柱分离对重组TsCDase进行纯化.酶学性质研究表明,重组TsCDase的比活为1 208.04 U/mg,最适温度为90℃、最适pH值为5.5.重组酶TsCDase在85℃、90℃、95℃条件下的半衰期分别为180、120、30min.酶转化研究表明,以80 g/L β-环糊精为底物,当酶转化温度为90℃、反应pH值为5.5～6.0,加酶量为25 U/g,反应时间为4 h时,麦芽七糖产率为81.19％和85.95％,七糖占产物麦芽寡糖的比例为95.24％和92.92％.本研究结果为工业化制备麦芽七糖奠定良好基础.     

基于麦芽糖诱导型启动子在枯草芽胞杆菌中异源表达麦芽四糖淀粉酶及其酶学性质的研究

麦芽四糖淀粉酶(Maltotetraose amylase, Mta)可以从淀粉的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键形成麦芽四糖,目前在食品、医疗保健和造纸等领域具有重要应用。构建安全、高效的表达系统强化麦芽四糖淀粉酶的重组表达,进而降低以其为核心酶的麦芽四糖生物转化过程的生产成本具有迫切的现实需求。本研究将源自Pseudomonas saccharophila(DSM 654)的麦芽四糖淀粉酶基因mta在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中重组表达,利用麦芽糖诱导型启动子实现其安全高效表达,之后对重组酶进行分离纯化和酶学性质表征。结果显示,将携带麦芽糖诱导型启动子P_glv的表达载体转入B.subtilis WB800N中,成功构建工程菌后进行诱导表达,并且利用金属离子螯合层析技术成功获得了Mta纯酶。酶学性质研究结果显示其最适反应温度为55℃,最适反应pH为7.5。动力学常数K_m为(1.26±0.17) g/L、k_cat/K_m为(2 275.07±32.83) L/s·g,...     

重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

将来自于Bacillus circulans 251的β-CGTase编码基因克隆到表达载体pET-20b(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)。经酶活检测培养基上清中的β-CGTase酶活为20 U/mL。对酶转化淀粉生成β-环糊精的反应条件进行了优化,结果表明,当底物马铃薯淀粉浓度15%,反应初始pH5.5,温度30℃,加酶量10 U/g干淀粉,环己烷浓度2.5%-5%(V/V),转化周期24 h,β-环糊精转化率达到最高值75.3%,是国内外报道的酶法生产β-环糊精的最高水平。     

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析

将来源于Bacillus sp 602 -1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(ot-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E coli M15后,得到重组菌株E coli M15 (PQE30/cgt).在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌.酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果.通过SDSPAGE验证了上述结论.酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1％可溶淀粉24h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2％,α和β的峰面积比约为3.4:1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景.     

Gluconobacter oxydans木糖醇脱氢酶基因的克隆表达及木糖醇的转化分析

从氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的基因组DNA上扩增出木糖醇脱氢酶基因xdh,构建了诱导型表达载体pSE-xdh,导入E.coli JM109后获得了高效表达木糖醇脱氢酶基因的重组菌JM109/pSE-xdh。通过HisTrap HP亲和层析和SephacrylS 300分子筛两步纯化从细胞中得到纯酶,并对酶学性质进行研究。XDH最适还原反应的pH值为5.0,最适还原反应的温度为35℃;最适氧化反应的pH值为11.0,最适氧化反应的温度为30℃。重组菌中的XDH依赖NADH,对NADH的米氏常数Km=57.8 mmol/L,最大反应速率Vmax=1209.1 mmol/(ml·min)。重组菌的XDH酶活力为13.9 U/mg。利用重组菌和原始菌混合静止细胞转化D 木酮糖,16 h 28.0 g/L D木酮糖生成16.7 g/L木糖醇,而原始菌单独转化只生成8.3 g/L木糖醇。     

扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质

通过PCR方法从扣囊复膜孢酵母基因组DNA中克隆获得α-淀粉酶基因成熟肽编码区（SfA）,插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLACl的d因子信号肽下游,构建重组表达载体pKLACl-SfA。重组载体转化乳酸克鲁维酵母GG799,筛选获得表达α-淀粉酶SfA水平较高的重组茵。酶活检测和SDS．PAGE电泳检测均显示,重组茵分泌重组酶SfA到发酵液中。酶学性质研究表明：SfA最适温度为45℃,最适pH5．0,在pH4．5～5．5、50℃条件下保持稳定。Ca2＋等二价金属离子对SfA酶活有激活作用,EDTA强烈的抑制SfA活性。HPLC分析显示SfA水解糊精获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽三糖是主要产物,占水解产物总量的52％。     

β-环糊精葡基转移酶的纯化方法及酶学性质的研究

β-环糊精葡基转移酶的粗酶液应用酚酞分光光度法测得该酶的环化活性为11.79U/mL。该粗酶液先经过淀粉-酒精沉淀或淀粉-硫酸铵沉淀初步纯化,然后经Sephacryl S-100凝胶层析后,比活力分别提高了16、21、50倍,由原来的11.44U/mg蛋白质增加到572.67U/mg蛋白质,回收率分别为72.4%、66.4%、40.9%,经SDS-PAGE电泳显示为单一的蛋白带,酶的分子量约为70kDa。酶学性质研究表明该酶的最适pH和最适温度分别为6.0和60℃,在pH6.0~10.0范围内,55℃以下保温30min基本保持稳定。纯化后的β-环糊精葡基转移酶的环化活性每克相当于35727U。     

麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是一种新型外切淀粉酶,从淀粉的非还原末端特异地顺序切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域.对来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的麦芽四糖淀粉酶基因序列进行优化,优化前后基因序列同源性达75％.将优化合成的成熟肽基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性、多步纯化,获得有活性的麦芽四糖淀粉酶.将麦芽四糖淀粉酶与不同来源的淀粉水解反应,结果表明,该酶能与7种不同来源的淀粉反应产生单一的麦芽四糖.经SDS-PAGE电泳,DNS法和硅胶板薄层色谱分析法(TLC)进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶的分子量约为57kDa,纯化后的酶液最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0.研究结果为麦芽四糖淀粉酶的研究和开发提供依据和参考.     

软腐芽孢杆菌D20产环糊精葡糖基转移酶的条件和酶性质

软腐芽孢杆菌(Bacillus macerans)D20菌株在适宜培养基中产大量环糊精葡糖基转移酶。玉米淀粉、硫酸铵和麦麸是适合的营养物质。酶反应最适pH为5.5,温度为50℃,酶用量为500U／g以上。A-、β-和r-GD产量比约为61：32：7。据此,作者认为,该菌株可用于环糊精生产工业。     

1株高产蛋白酶嗜麦芽寡养单胞菌的分离鉴定及其酶学活性的研究

双齿围沙蚕消化道中分离1株高产蛋白酶菌株D2(CGMCC保藏号:1868),经形态学、生理学、16S rRNA基因序列测定及系统发育分析确定为嗜麦芽寡养单胞菌。Lowry法检测显示该菌株产酶能力为1104 U/mL,最佳产酶条件为pH 8.0、25℃培养48 h;酪蛋白酶图谱法和凝胶成像分析证实其蛋白酶分子量约为42 ku,在培养上清液中纯度大于97%;该酶对粗酶品比活性为301 U/mg,酶活性的最适pH值为9,是一种碱性蛋白酶;最适温度为60℃;在55℃以下及pH 6~10的环境中具有较好的稳定性。嗜麦芽寡养单胞菌D2株有望成为一种新的蛋白酶生产资源。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.