利用RAPD—PCR检测三种白僵菌及球孢白僵菌种内变异

采用ＰＣＲ－ＲＡＰＤ技术研究了球孢白僵菌２株野生型多孢株及其各１株单孢分离株的ＲＡＰＤ扩增片段的多态性,比较了彼此间的相似率。结果显示,相似率在６３．６－９９．３％之间变化很大,表明各分离子间的基因组ＤＮＡ已发生变化。     

球孢白僵菌两种施用方式对侵染桔小实蝇的影响及田间的防治效果

室内研究了球孢白僵菌Beauveria bassiana不同施用方式对侵染桔小实蝇Bactrocera dorsalis的影响,以及田间喷施球孢白僵菌防治桔小实蝇的效果。结果表明,两种诱集感染方式桔小实蝇成虫存活率分别为40%、41.7%,差异不显著;添加性引诱剂在白僵菌侵染桔小实蝇的过程中没有起到明显地促进感病的作用,只是缩短了病程,IIPC为0.41-0.44,说明两种诱集感染方式对桔实蝇成虫有一定的控制作用。三种施菌方式的桔小实蝇羽化率、成虫死亡率与对照差异均显著;以IIPC为评价指标,施菌方式对桔小实蝇各因子的影响大小顺序为：成虫存活率 >羽化率>化蛹率,其中以对成虫存活率的影响最大。应用化学防治和球孢白僵菌田间防治桔小实蝇的效果表明,施用2500倍40%毒死蜱效果最好,控制作用达到71.9%,其次是喷施2.0×108孢子/mL球孢白僵菌孢子悬浮液,防效达46.9%,施用2500倍4.5%高效氯氰菊酯防治效果达最差, 防效仅37.5%。     

二种交配型球孢白僵菌对亚洲玉米螟的生态控制作用

利用生物种间互做关系抑制农业害虫的暴发是生物防治的重要手段。为探讨二种交配型内共生球孢白僵菌与玉米之间的互惠关系及其形成的共生体在亚洲玉米螟控制中的生态效应,以玉米为宿主植物,以球孢白僵菌孢子悬浮液进行灌根,在温室内构建了二种交配型(MAT1-1-1型,B5;MAT1-2-1型,B2)球孢白僵菌-玉米共生体,并研究了共生体对玉米的生长、对亚洲玉米螟的产卵选择和幼虫发育及其对球孢白僵菌生物学特性的影响。结果显示:通过叶片离体培养、ITS基因和交配型基因MAT检测,均能检测到白僵菌的内生定殖;MAT1-2-1型B2菌株定殖检出率高,MAT1-1-1型B5菌株在混合型接种中定殖有优势。回收后的球孢白僵菌菌落直径和毒力无显著性变化,但其产孢量都显著提高其中回收B5处理组来源菌株的产孢量提高最显著。接种过球孢白僵菌的玉米植株地上部生长速度、生物量和地下根系生物量均优于对照组,其中根系干重明显增加,而地上植株干重也相对增加。MAT1-1-1型菌株B5对共生体玉米植株地上高度促生长贡献明显;MAT1-2-1型菌株B2对共生体玉米植株地下干重增加贡献明显。总体上球孢白僵菌内生定殖对玉米地下根系生物量影响大于对地上植株生物量的影响。在产卵选择性试验中,各处理组亚洲玉米螟的产卵量显著少于对照组。共生体对亚洲玉米螟产卵具有明显的趋避作用,MAT1-2-1型菌株B2对产卵的趋避作用明显,而MAT1-2-1型菌株B5的趋避作用较弱。在人工接种幼虫的试验中,处理组回收的亚洲玉米螟幼虫存活率均显著低于对照组,其中,B5组回收幼虫的存活率最低,仅为38.33%;处理组的化蛹率与对照组差异不显著,但B5组的回收幼虫化蛹率显著低于B2组和对照组,仅为34.77%,这说明MAT1-1-1型B5菌株对玉米螟幼虫发育抑制最明显。上述结果表明,不同交配型球孢白僵菌内生定殖效率有差异,在经过内生定殖后在产孢量方面有显著性提高,两个交配型菌株在联合应用时具有协同增效作用;两个交配型菌株均能够通过内生定殖与玉米形成共生体并促进玉米植株的生长,这显示球孢白僵菌和玉米之间已经建立具有互惠关系的共生体。这种共生体通过趋避亚洲玉米螟产卵、抑制幼虫存活和降低化蛹率等方面的潜力虽然不一样,但都有助于对亚洲玉米螟的可持续生态防治,也证明了共生体的建成有效提高了玉米的生态适应性,为利用球孢白僵菌内共生性实施亚洲玉米螟防控提供了新思路。     

球孢白僵菌响应氧化胁迫的分子机制研究进展

球孢白僵菌作为模式丝状真菌,以分生孢子、菌丝体、虫菌体等多种形态存在,在真菌孢子发育、寄主与宿主互作的研究中具有重要意义。同时,球孢白僵菌又是一类广泛应用的真菌杀虫剂,对森林防护和农业生产具有实际应用价值。球孢白僵菌的相关基因被敲除后,突变体响应氧化胁迫,孢子发育和毒力会发生改变。本文综述了近年来球孢白僵菌在响应氧化胁迫方面的研究进展,为丝状真菌氧化胁迫信号途径的研究提供参考。     

球孢白僵菌不同分离株的生物学及对小猿叶甲成虫致病性测定

球孢白僵菌Beauveriabassiana是一种寄主范围广、致病性强、适应性广的昆虫病原真菌。对采自广东阳山小猿叶甲Phaedonbrassicae的球孢白僵菌 6个分离株 (A ,B ,C ,D ,E ,F)的菌落生长速率、产孢量、分生孢子萌发率进行了实验 ,测定和比较了这 6个分离株对小猿叶甲成虫的致病力。结果表明 :各分离株在菌落生长速率上没有显著差异 ,但各分离株的孢子萌发率有显著差异 ,其中C ,D ,E分离株产孢量明显高A ,F分离株。用 5× 1 0 7分生孢子 mL的悬浮液处理小猿叶甲成虫 ,分离株间的致病力有显著的差异 ,以D分离株对小猿叶甲成虫的感染死亡率最高 ,为 86 67%。综合比较 ,产孢量和致病性较高的D分离株可作为进一步研究的材料。     

球孢白僵菌种群野生菌株异核现象的分子验证

球孢白僵菌28S rRNA基因D11域由于一内含子的存在与否,引起这一区域的扩增产物有两种片段类型（约520bp及120bp),将此作为分子标记分析了球孢白僵菌的117个菌株,发现17％菌株的扩增产物为双片段类型,即为异核体,异核体在不同种群中的分布频率因地理生态条件而异,单孢分离分析表明,异核体的分离频率约为35％,RAPD检测结果说明异核体在准性循环中发生了不同程度的遗传交换及遗传重组,球孢白僵菌异核体在继代培养中极不稳定。     

球孢白僵菌羧基转运蛋白基因BbJEN1及其上游序列的克隆与分析

在分析一株球孢白僵菌TDNA插入突变体T12的Tagging序列的基础上,根据与其具有高度同源性的一条金龟子绿僵菌EST序列（编号为AJ273226）设计简并引物,用YADE法从球孢白僵菌中扩增出该EST的同源序列及其延伸序列。序列分析表明,该片段与粗糙脉孢霉的羧基转运蛋白JEN1具有高度同源性,由此确定该序列为球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1基因的部分序列。然后利用YADE法延伸扩增该序列的上、下游序列,获得球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的全长DNA序列,命名为GBbJEN1。利用3′RACE扩增出球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的cDNA序列,命名为BbJEN1。BbJEN1全长1656bp,编码514个氨基酸的蛋白。推测蛋白分子量为55975.37Da,等电点9.32。氨基酸序列与金龟子绿僵菌、粗糙脉孢霉和酿酒酵母羧基转运蛋白JEN1的同源性分别为77%、66%和30%。序列分析表明,GBbJEN1含有2个内含子。Southern杂交表明,GBbJEN1基因在球孢白僵菌基因组中为单拷贝。利用RTPCR法对BbJEN1的表达特性进行了分析,结果发现BbJEN1基因的转录受蟑螂壳、蝉蜕等昆虫体壁的诱导,受葡萄糖的抑制。进一步利用YADE法获得了长为977bp的GBbJEN1上游序列,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列和压力反应元件。     

利用冷冻切片对球孢白僵菌侵染西花蓟马过程的观察

为探索球孢白僵菌对西花蓟马的侵染,研究球孢白僵菌在西花蓟马体表和虫体内的侵染过程,采用冷冻切片与HE染色技术,对被球孢白僵菌侵染的西花蓟马成虫进行组织切片及HE染色。结果表明,接菌4 h,体表粘附的孢子开始萌发,8-12 h芽管继续伸长并出现穿透体壁。18 h虫菌体出现在西花蓟马体内,球孢白僵菌成功侵入西花蓟马体内。之后,西花蓟马体内虫菌体、菌丝明显增多,各组织器官均受到感染,消化道、肌肉组织等发生病变。     

家蚕病原球孢白僵菌的原生质体再生回复及核型分析

家蚕病原球孢白僵菌（Beauveriabassiana）原生质体的分离制备、性状及再生回复,并用脉冲凝胶电泳（PFGE）技术分析了其核型。以6mg／mLDriselase为酶解液,0.7mol／LNaCl液（pH5.8）为渗透压稳定剂,在30℃下轻轻振荡处理幼嫩菌丝1．5h,是原生质体分离的适宜条件。原生质体的无核率为26．5％,有核率为73.5％,其中单核率为53.5％。再生回复的形式可观察到三种,其培养基的渗透压稳定剂以0.7mol／L葡萄糖较为适当。球孢白僵菌至少具有6条染色体,估算大小为2.5～6.6Mb,核型大小为26.5Mb。     

球孢白僵菌的侵染特性及应用研究进展

球孢白僵菌是一种重要的虫生真菌,具有致病力强、侵染范围广、安全无污染等优点,其制剂可作为一种真菌类杀虫剂应用于农林业害虫的防治,也可用于人工生产中药材僵蚕。本文综述了球孢白僵菌的培养性状、侵染特性、应用生产和存在的问题,并提出了发展对策,为球孢白僵菌的进一步开发应用提供参考。     

球孢白僵菌高壳聚糖酶突变株的筛选*

以球孢白僵菌 (Beauveriabassiana) 1 31 6为出发菌株 ,通过紫外线和高能电子束分别诱变分生孢子 ,采用平板透明圈法初筛和摇瓶培养复筛的方法 ,经 3轮诱变 ,筛选到 5株高产突变株。其中一株最高产的定名为Beauveriabassiana 131 6-V1 ,其壳聚糖酶活力是原始菌株的 1 6倍 ;而且经传代培养 ,其高产特性能够稳定遗传。     

球孢白僵菌高壳聚酶突变株的筛选

以球孢白僵菌（Beauveria bassiana)1316为出发菌株,通过紫外线和高能电子束分别诱变分生孢子,采用平板透明圆法初筛和摇瓶培养复筛的方法,经3轮诱变,筛选到5株高产突变株。其中一株最高产的定名为Beauveria bassiana 1316-V1,其壳聚糖酶活力是原始菌株的16倍;而且经传代培养,其高产特性能够稳定遗传。     

球孢白僵菌数量性状的典型相关分析*

来源不同的球孢白僵菌菌株的生物学性状（培养特征、产孢量、菌落生长速率及孢子萌发中时）、生态学性状（毒力、水分活性、紫外照射活率、水浴活率）及生物化学性状（草酸水平、蛋白酶产量、几丁质酶产量、葡萄糖苷酶产量、酯酶及脂肪酶产量）经观察测定,共得到１５个指标。对不同性状集团及其组合进行典型相关分析,结果表明生物学性状与生态学性状的相关主要为产孢量与菌株毒力及孢子水浴活率之间的相关。生物学与生物化学性状间的相关主要为产孢量与蛋白酶及草酸水平的相关;生态学与生物化学性状间的相关主要为水浴活率与草酸水平及蛋白酶产量间的相关;含培养特征的生物生态与生物化学性状的相关主要由菌落颜色、产孢量、毒力、水浴活率与蛋白酶、葡萄糖苷酶相关引起的;而不含培养特征的生物生态与生物化学性状相关主要由产孢量、毒力、水浴活率与草酸水平、蛋白酶、几丁质酶相关引起的。     

球孢白僵菌数量性状的典型相关分析

来源不同的球孢白僵菌菌株的生物学性状（培养特征、产孢量、菌落生长速率及孢子萌发中时）、生态学性状（毒力、水分活性、紫外照射活率、水浴活率）及生物化学性状（草酸水平、蛋白酶产量、几丁质酶产量、葡萄糖苷酶产量、酯酶及脂肪酶产量）经观察测定,共得到１５个指标。对不同性状集团及其组合进行典型相关分析,结果表明生物学性状与生态学性状的相关主要为产孢量与菌株毒力及孢子水浴活率之间的相关。生物学与生物化学性状间的相关主要为产孢量与蛋白酶及草酸水平的相关;生态学与生物化学性状间的相关主要为水浴活率与草酸水平及蛋白酶产量间的相关;含培养特征的生物生态与生物化学性状的相关主要由菌落颜色、产孢量、毒力、水浴活率与蛋白酶、葡萄糖苷酶相关引起的;而不含培养特征的生物生态与生物化学性状相关主要由产孢量、毒力、水浴活率与草酸水平、蛋白酶、几丁质酶相关引起的。     

球孢白僵菌种群野生菌株异核现象的分子验证*

球孢白僵菌28S rRNA基因D11域由于一内含子的存在与否,引起这一区域的扩增产物有两种片段类型(约520bp及120bp),将此作为分子标记分析了球孢白僵菌的117个菌株,发现17%菌株的扩增产物为双片段类型,即为异核体。异核体在不同种群中的分布频率因地理生态条件而异。单孢分离分析表明,异核体的分离频率约为35%。RAPD检测结果说明异核体在准性循环中发生了不同程度的遗传交换及遗传重组。球孢白僵菌异核体在继代培养中极不稳定。     

球孢白僵菌胞内几丁质酶的分离纯化及性质

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)突变株CH-1316细胞裂解液经(NH_4)_2SO_4沉淀,DEAE-纤维素层析及凝胶过滤,分离出一种几丁质酶,该酶的分子量为32000;最适pH为5.0;最适温度为40℃;最适离子强度为0.2mol/L NaCl;Hg²⁺、Fe²⁺是该酶的强抑制剂;该几丁质酶完全不水解纯的片状几丁质,脱矿几丁质也不是该酶的良好底物;该几丁质酶水解几丁寡糖,但不水解几丁二糖;对几丁五糖以上的寡糖水解速度较快,而对几丁三糖和四糖水解速度则慢得多。     

布氏白僵菌菌丝制剂的贮存活力

本试验制备了布氏白僵菌（Beauveriabrongniartii）9405的几种菌丝颗粒剂和粉剂,并测定其贮存活力。当贮存6个月时,在4℃和室温贮存的藻胶颗粒剂的存活率比贮存1个月时分别下降了31．4％～76．8％和76．0％～92．6％。4个粉剂中,7号和10号在4℃的存活率比贮存1个月分别下降11.0％和8．5％,而其它两个的存活率却略有增加;在室温贮存的存活率下降8．2％～33．1％。颗粒剂在土壤中有一个恢复生长过程,然后逐渐衰落。     

球孢白僵菌胞外壳聚糖酶的纯化和性质*

球孢白僵菌Beauveria bassiana 1316-V1的培养上清液经硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-75凝胶过滤,Chitosan-bead亲和层析,第二次Sephadex G-75凝胶过滤, 得到电泳纯的一种胞外壳聚糖酶,比活力达到45u/mg 。此酶的分子量为36 kD; 最适酶反应温度为60℃;最适pH为4.0;最适离子强度为 0.25mol/L NaCl; 37℃以下,pH 2.0~5.0之间稳定性好; Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ni2+ 对该酶有强烈抑制作用;Ag+、Mn2+也有较强抑制作用;Fe2+有轻微激活作用。该壳聚糖酶是一种糖蛋白,含糖约为12.6%。酶的最适底物为脱乙酰度为90%的胶体壳聚糖;也能轻微水解CMC、DEAE-Cellulose和胶体几丁质;但不能水解片状的壳聚糖和几丁质。     

球孢白僵菌凝乳弹性蛋白酶(BbPr1)的纯化与特性*

以几丁质为底物,加入基本盐培养基中,诱导球孢白僵菌（Beauveriabassiana）产生分解昆虫表皮的蛋白酶。诱导物中,蝉蜕诱导的蛋白酶总活性、比活较高,经超滤、离子交换层析、亲和层析、制备性IEF电洗脱纯化了一种有凝乳弹性蛋白酶（Pr1）活性的蛋白酶BbPr1。经SDS－PAGE电泳银染后是单带,HPLC凝胶过滤显示单峰。BbPr1为单体酶,分子量为33.6kD左右,pI为7.4。底物专一性测定显示,BbPr1能水解Phe或Leu形成的酸胺键和肽键。BbPrl可被PMSF抑制,表明其活性中心有Ser残基;BbPr1还可被胰凝乳蛋白酶抑制剂TPCK和凝乳弹性蛋白酶抑制剂TEI等所抑制;胰蛋白酶抑制剂beupeptin和Epianstatin,及胃蛋白酶抑制剂Pepstain对BbPr1活性无影响。还研究了BbPr1的最适作用pH和pH稳定性。