丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展

丝状真菌,俗称霉菌,在食品工业中被用于生产多种生物酶和有机酸。近年来,人们发现丝状真菌具有分泌量大、表达的蛋白有天然活性等特点,非常适合作为同源和异源重组蛋白的表达宿主,因此被广泛研究和探讨。简要综述了以黑曲霉为代表的几种常被用作蛋白表达宿主的丝状真菌的特点、应用中的主要问题和基本解决方案,以及近年关于丝状真菌表达系统的最佳培养条件和发酵条件的研究进展。     

丝状真菌表面展示技术研究进展

丝状真菌表面展示技术是将表达的目的蛋白固定在丝状真菌细胞表面的一项新兴基因工程技术。丝状真菌具有极强的蛋白质分泌能力和良好的蛋白质翻译后加工能力,因而越来越多的丝状真菌表面展示技术得到开发和应用。本文就丝状真菌表面展示系统的研发和应用进展进行综述,并介绍与该系统构建密切相关的丝状真菌的细胞壁组成、锚定蛋白和遗传转化方法等技术。     

丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展

丝状真菌是具有高效分泌蛋白质潜力的真核表达系统, 能对蛋白质进行翻译后修饰, 如蛋白质糖基化等; 并且比植物、昆虫和哺乳动物细胞具有更快的生长速率。近年来, 随着真菌分子遗传技术和菌种改良策略的进步, 尤其是真菌基因组学的发展, 利用丝状真菌生产异源蛋白越来越受到关注。综述了丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的最新探索与进展, 其中包括功能基因组学在蛋白表达与分泌研究中的应用, 同时探讨了异源蛋白表达和生产的改进策略。     

丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展

丝状真菌是具有高效分泌蛋白质潜力的真核表达系统, 能对蛋白质进行翻译后修饰, 如蛋白质糖基化等; 并且比植物、昆虫和哺乳动物细胞具有更快的生长速率。近年来, 随着真菌分子遗传技术和菌种改良策略的进步, 尤其是真菌基因组学的发展, 利用丝状真菌生产异源蛋白越来越受到关注。综述了丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的最新探索与进展, 其中包括功能基因组学在蛋白表达与分泌研究中的应用, 同时探讨了异源蛋白表达和生产的改进策略。     

哺乳动物细胞高效表达系统研究进展

哺乳动物细胞高效表达系统是基因工程制药研究中的一个重要内容,而表达载体和宿主细胞是哺乳动物细胞表达系统的2个基本组成部分。近年来通过降低目的基因的位置效应、提高目的基因的转录和翻译水平以及目的基因的拷贝数等方面构建哺乳动物细胞高效表达载体。与此同时,研究也对宿主细胞进行了多方面的改造,使之能更好地适应工业化大规模培养的要求,从而降低细胞培养和产品纯化的成本。本就哺乳动物细胞高效表达载体的构建及宿主细胞的改造等方面的最新进展作一简述。     

后基因组时代的丝状真菌基因组学与代谢工程

丝状真菌不仅是传统发酵工业中抗生素、酶制剂和有机酸的主要生产者,而且也是代谢工程育种中异源蛋白表达的重要细胞工厂。丝状真菌的遗传修饰和代谢工程研究是现代工业生物技术领域最具活力的研究方向之一。特别是与细菌和酵母相比,丝状真菌在细胞生长、营养需求、环境适应性、翻译后修饰、蛋白分泌能力和生物安全性等方面具有显著的优势。文章综述了丝状真菌作为异源蛋白表达系统在基因组学技术研究和代谢工程研究方面的最新进展。作者在分析丝状真菌基因组结构、特点的基础上,阐述了比较基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学等对丝状真菌的代谢途径重构、新型蛋白挖掘和代谢工程育种中的作用和意义。另一方面,作者分析了丝状真菌在表达外源蛋白时遇到的瓶颈问题,总结了丝状真菌代谢工程育种中的常用策略包括异源基因的融合表达、反义核酸技术、蛋白分泌途径改造、密码子优化和蛋白酶缺陷宿主的选育等技术和手段。最后,对该领域的发展趋势进行了展望。     

纳米抗体异源表达的研究进展

羊驼体内存在天然缺失轻链的重链抗体(HcAb),其单域抗原结合片段也称为VHH或纳米抗体(nanobody,Nb),是目前已知的最小抗原结合片段。与传统抗体相比,纳米抗体具有分子量小(12~15kDa)、稳定性好和免疫原性低等特点,这些特点使得VHH在基础研究、诊断及治疗上具有极大的应用价值,目前已有多种纳米抗体进入了临床研究阶段。综述了近年来VHH在革兰氏阴性菌(大肠杆菌)、革兰氏阳性菌(芽孢杆菌和乳酸杆菌)、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞中异源表达的研究现状,包括表达系统、宿主、载体特点、载体构建方式及产量等;从分子水平、表达水平和理性设计三个层面探讨了纳米抗体产量提高的策略,以期为纳米抗体研究者提供借鉴和思路。     

基于启动子和宿主改造的酿酒酵母表达系统优化研究

生物医药领域中一套高效表达系统对于重组蛋白的生产至关重要。酿酒酵母作为一种食品级真核微生物,具有繁殖迅速、培养简单、遗传操作便捷等特点,是生产重组蛋白较理想的表达系统之一。对实验室已有的p HR酿酒酵母表达系统进行优化。分别通过易错PCR技术和菌株诱变技术对酿酒酵母启动子PTEF和宿主酿酒酵母Y16进行突变改造,经筛选、鉴定获得表达性能提高的启动子PTEFV1和酿酒酵母Y16-E14、Y16-E19。随后,利用启动子PTEFV1构建以Y16-E14为宿主的p HR-N酿酒酵母表达系统,以绿色荧光蛋白和人血清白蛋白为对象,比较表达系统改造前后性能变化。结果显示p HR-N酿酒酵母表达系统无论胞内表达绿色荧光蛋白还是分泌表达人血清白蛋白的能力均较改造前明显提高。p HR-N系统为获得更多具有重要应用价值的重组蛋白提供了有利的工具。     

粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究北大核心CSCD

旨在将模式丝状真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)构建为蛋白质表达系统。通过真菌杂交技术构建出粗糙脉孢菌六突变缺失菌株LQ-1(Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3)作为蛋白表达宿主菌株。该宿主菌株可以用纤维二糖作为诱导物诱导纤维素酶启动子表达,同时又消除了葡萄糖苷酶蛋白的背景条带,有利于目标蛋白表达纯化。构建了分别含有粗糙脉孢菌自身强启动子(Pcbh-1、Pcbh-2和Ptef-1)的3个新的高效表达载体,该载体带有融合标签蛋白tev-6×his-gfp,能高效方便的筛选阳性转化子,有利于后续目标蛋白纯化。以纤维素酶GH3-4和CBH-1为例,通过重组表达菌株纤维二糖诱导发酵液进行酶活测定、SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测显示,重组蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP成功进行了表达和分泌,分泌水平分别为2.77和2.83 mg/L。Pcbh-1启动子重组蛋白表达水平最高,说明在纤维二糖诱导体系中启动子Pcbh-1的启动效率最高,初步建立了粗糙脉孢菌纤维二糖诱导的蛋白质表达体系。     

米曲霉外源表达系统研究进展

丝状真菌米曲霉是发酵工业的重要菌种,具有强大的蛋白分泌能力和较高的食品安全性,可作为表达外源蛋白的细胞工厂。近年来,米曲霉全基因组序列的测序完成和基于表达序列标签的基因组学研究,为深入研究米曲霉外源表达系统提供了条件。从基因组学进展、遗传转化体系等方面综述了米曲霉作为外源蛋白表达宿主的研究进展。针对米曲霉在外源蛋白表达中存在的瓶颈,提出构建蛋白酶缺陷株、使用强启动子、融合表达等策略,以提高外源蛋白的表达和产量。最后介绍了米曲霉表达系统的应用,利用米曲霉代谢工程菌生产工业用酶和次级代谢产品具有良好的前景。     

带有报告基因的板栗疫病菌寄生隐赤壳分泌表达突变体库的构建及分泌缺陷突变体的筛选

丝状真菌分泌蛋白与其致病性密切相关,目前对于病原真菌的蛋白胞外分泌途径及其调控机制的报道不多。为建立一个方便高效的真菌分泌蛋白调控途径的遗传研究体系,本研究以植物病原丝状真菌——板栗疫病菌寄生隐赤壳Cryphonectria parasitica为对象,选取分泌表达量最高的两个分泌蛋白的信号肽SP1和SP2,分别构建带有GUS报告基因的分泌蛋白表达载体pCPXBle-SP1-GUS和pCPXBle-SP2-GUS并用于转化板栗疫病菌。选择高效分泌GUS蛋白的转化株SP1-9为出发菌株,利用农杆菌介导的遗传转化技术构建了T-DNA插入突变体库,从576个突变体中筛选到2株GUS分泌表达明显降低的突变体。本研究成功构建了可用于研究丝状真菌蛋白分泌的遗传研究体系,并筛选获得了分泌蛋白缺陷突变体,为深入研究丝状真菌分泌途径及其调控机制奠定了基础。     

纳木措可培养丝状真菌多样性及其与理化因子关系

微生物多样性在评估水体生态环境方面发挥着重要作用。本研究以青藏高原纳木措湖为研究对象, 开展水体可培养丝状真菌多样性及影响因子研究。通过膜过滤平置培养法、经典分类法和rRNA转录间隔区(ITS)序列分析对纳木措湖20个采样点的丝状真菌进行分离、纯化及鉴定, 测定水体理化指标, 综合分析丝状真菌空间分布格局与理化因子的相关性。菌种鉴定结果显示, 从纳木措水体样品中共分离纯化出1,412株丝状真菌, 隶属22属47种, 其中链格孢属(Alternaria)、青霉属(Penicillium)和毛霉属(Mucor)为优势属, 链格孢(Alternaria chlamydosporigena)和冻土毛霉(Mucor hiemalis)为优势种; Pearson相关性分析显示, 丝状真菌总丰度与温度、铵态氮、全磷呈显著正相关; 冗余分析显示, 铵态氮、温度、全磷、全氮、盐度及电导率是影响纳木措湖丝状真菌群落组成与分布的主要理化因子。综上所述, 纳木措水体可培养丝状真菌具有较高的物种多样性和空间异质性, 而且水体环境因子影响其分布。     

Gene expression systems for filamentous fungi.

The extraordinary capacity of filamentous fungi to produce large quantities of extracellular protein, together with the advent of DNA-mediated fungal transformation, has resulted in rapid advances in the development of gene expression systems for filamentous fungi. This review focuses on recent developments in the expression of both fungal and non-fungal genes and improvements to the host.     

比较分析草菇与其他真菌直系同源基因的关系

担子菌类的食用菌种类多、价值高、产量大,然而其产业的升级发展需要对食用菌生长发育相关生物学问题进行深入解析。目前多种食用菌完成了全基因组测序,然而作为非模式种其与模式丝状真菌间的直系同源基因目前尚缺乏全基因组水平的系统研究,在一定程度上限制了其分子生物学研究的深入。本研究以草菇为参照物种,将其与几种食用菌和模式丝状真菌进行两两直系同源基因分析,并对多物种间不同类型的直系同源基因进行功能富集。结果显示：一对一直系同源基因较多富集于基因复制、转录、翻译、修饰、加工等保守的基本功能类别;非一对一直系同源基因多属于基因家族,且包含了65%的转录因子,功能上富集在碳水化合物、脂质、氨基酸、次生代谢物及外源物质的代谢通路。无直系同源基因则较多富集在与基因重组、修复、信号转导相关的功能类别、特导性转录因子以及未知的预测基因。结果为食用菌分子生物学的深入研究提供有价值的参考。     

我国南方不同产量的八角树内生真菌群落研究

八角Illicium verum原产于我国华南和越南北部,是我国传统的香料和药用植物。内生真菌可提高植物生长与产量。然而,八角的产果量与其内生真菌间的关系尚未有人报道。为揭示内生真菌与八角产量的关系,本文分析了广西壮族自治区不同八角产量植株的内生真菌定殖率和群落组成。从60棵植株的叶片中分离到412株内生真菌,并根据形态学和分子生物学方法将其鉴定为22个真菌分类单元。内生真菌群落的优势类群分别为Colletotrichum gloeosporioides、Dermateaceae sp.和Phyllosticta sp. 1。内生真菌定殖率的变化范围为6%-100%,平均值为41%。内生真菌的定殖率与八角产量的回归分析表明,在较低和中等产量的八角植株中,内生真菌定殖率与产量呈正相关,而在高产的八角植株中,内生真菌定殖率与产量呈负相关。     

涠洲岛火山口真菌的分离及次级代谢产物鉴定

涠洲岛火山口生态环境特殊,蕴藏着丰富且独具特色的微生物资源。关于涠洲岛火山口海洋真菌来源的次级代谢产物鲜有报道。本研究采用两种培养基从涠洲岛火山口海洋植物中分离真菌,对菌株的代谢产物进行分离纯化,并通过波谱等方法鉴定化合物结构。从4种涠洲岛火山口附近的海洋植物样本中分离真菌共31株,从菌株青霉菌Penicillium sp. TX-M1-3和Penicillium sp. LW-2-1的发酵物中纯化获得2个主要次级代谢产物,并鉴定为核丛青霉素和弯孢霉菌素。活性评价表明核丛青霉素对NPC1L1蛋白具有一定的抑制作用,暗示其在治疗心血管疾病方面的潜力。本结果拓展了涠洲岛火山口微生物资源及其次生代谢产物方面的研究,为该地区微生物与其次生代谢产物的研究提供了相关基础。     

Isolation and characterization of some mycelia inhabiting Tuber ascomata

Tuber spp. are ectomycorrhizal ascomycetes that produce subterranean ascomata known as truffles. Truffles can be regarded as complex microhabitats hosting bacteria and yeasts. In this paper we show that guest filamentous fungi are also associated to truffle ascomata, regardless of the Tuber spp., and report the morpho-molecular characterization of seven truffle-hosted mycelia isolated from healthy and intact Tuber ascomata. Some of these isolates were shown to be related to the fungal endophytes of plants. Interestingly, the truffle-hosted mycelia grew stuck to the hyphal wall of their partner when co-cultivated with the Tuber borchii mycelium, but not when co-cultivated with the test species Agaricus macrosporus. The present data suggest that guest filamentous fungi can be added to the list of truffle-interacting microorganisms.