从天然产物到新农药创制——杀虫植物苦皮藤研究进展

天然产物是新农药创制的重要资源。苦皮藤(Celastrus angulatus)是一种传统杀虫植物,广泛分布于我国长江和黄河流域的丘陵浅山地区。1980年以来作者对苦皮藤进行系统的研究,获得下列重要成果:(1)从苦皮藤根皮和叶子的提取物中分离、鉴定出54个化合物,其中37个为新化合物,这些化合物都属于倍半萜多元醇酯,具有二氢沉香呋喃的骨架结构。(2)以苦皮藤素V和双呋喃二氢沉香呋喃为起始化合物,修饰合成一系列衍生物,其中一些化合物的杀虫活性高于天然产物苦皮藤素V。(3)作用机理研究结果表明:阻断昆虫神经-肌肉兴奋性接点电位的传导及对钙通道的抑制可能是麻醉成分苦皮藤素IV的主要作用机理;而和昆虫中肠肠细胞的特异性受体结合,从而改变细胞膜的结构,破坏细胞膜的正常功能可能是毒杀成分苦皮藤素V的主要作用机理。(4)研制出0.2%苦皮藤素乳油、0.15%苦皮藤素微乳剂及0.15%苦皮藤素微粉剂,其中0.2%苦皮藤素乳油于2001年投入批量生产,取得明显的经济效益和环境生态效益。     

苦皮藤素Ⅴ对东方粘虫肌细胞的影响

苦皮藤素Ⅴ是从杀虫植物苦皮藤Celustrus angulatus Max.根皮中分离的一种对昆虫具毒杀活性的新化合物。采用电子显微镜技术研究了苦皮藤素Ⅴ对东方粘虫Mythimna separata（Walker）肌肉系统的作用。电镜观察发现,苦皮藤素Ⅴ对东方粘虫成虫飞行肌和幼虫体壁肌均具致毒作用,中毒试虫肌细胞特别是肌细胞的质膜及内膜系统发生明显病变：肌膜破坏,脱落;线粒体肿胀,空泡化,崩解;肌原纤维与线粒体间间隙增大;肌质网扩张,产生髓鞘样结构;细胞核肿胀,核质浓缩,核膜破坏;微气管与肌细胞之间间隙增大;肌小节弥散、排列紊乱。这些结果表明,肌细胞质膜及内膜系统可能是苦皮藤素Ⅴ的一个作用部位。     

苦皮藤素Ⅴ对东方粘虫肌细胞的影响

苦皮藤素Ⅴ是从杀虫植物苦皮藤 Celustrus angulatus Max.根皮中分离的一种对昆虫具毒杀活性的新化合物.采用电子显微镜技术研究了苦皮藤素Ⅴ对东方粘虫 Mythimna separata (Walker)肌肉系统的作用.电镜观察发现,苦皮藤素Ⅴ对东方粘虫成虫飞行肌和幼虫体壁肌均具致毒作用,中毒试虫肌细胞特别是肌细胞的质膜及内膜系统发生明显病变:肌膜破坏,脱落;线粒体肿胀,空泡化,崩解;肌原纤维与线粒体间间隙增大;肌质网扩张,产生髓鞘样结构;细胞核肿胀,核质浓缩,核膜破坏;微气管与肌细胞之间间隙增大;肌小节弥散、排列紊乱.这些结果表明,肌细胞质膜及内膜系统可能是苦皮藤素Ⅴ的一个作用部位.     

我国卫矛科杀虫植物研究进展

卫矛科植物由于具有独特的生物活性而受到广泛关注。作者主要综述了我国对卫矛科杀虫植物的研究进展。迄今为止,该科植物中发现的主要杀虫成分均是以二氢沉香呋喃为骨架的多元醇酯和生物碱。就杀虫活性而言,主要是对昆虫拒食作用的测定,仅对苦皮藤(Celastrus angulatus)和雷公藤(Tripterygium wilfordii)杀虫成分的毒杀、麻醉等胃毒作用的研究比较系统深入。此外,也对当前这些研究中存在的问题及前景进行了分析。     

苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ混合物对果蝇幼虫神经肌肉兴奋性接点电位的影响

利用细胞内微电极记录技术研究了杀虫植物苦皮藤Celastrus angulatus Max.中麻醉成分苦皮藤素Ⅳ和毒杀成分苦皮藤素Ⅴ混合物对果蝇Drosophila melanogaster 3龄幼虫腹纵肌神经肌肉兴奋性接点电位（EJPs）的作用。结果表明,苦皮藤素Ⅳ比例较高（Ⅳ∶Ⅴ= 3∶1）时对EJPs的影响与单用苦皮藤素Ⅳ差不多,而苦皮藤素Ⅴ比例较高（Ⅳ∶Ⅴ= 1∶1和1∶3）时可使EJPs阻断时间明显延长。根据以上结果初步认为,虽然苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ单独对EJPs的阻断作用基本相似,但它们对突触谷氨酸受体通道的影响存在明显差异。     

卫矛科植物苦皮藤杀虫成分化学研究新进展

卫矛科植物苦皮藤(Celastrus angulatus Max.)是我国著名的杀虫植物。近些年来,我国对这一杀虫植物从化学和生物学的角度进行了多学科的交叉研究。本文结合笔者近年来的研究,从苦皮藤的杀虫化学成分的结构、构效关系、环境中的稳定性以及结构修饰等方面综述了对苦皮藤杀虫成分化学研究的新进展。     

苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ混合物对棉铃虫幼虫神经细胞钠通道的影响

杀虫植物苦皮藤Celastrus angulatus的主要活性成分苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ处理后昆虫的中毒症状分别表现为麻醉和兴奋,但苦皮藤素Ⅳ对苦皮藤素Ⅴ的毒杀效果具有增效作用,苦皮藤素Ⅴ对苦皮藤素Ⅳ的麻醉作用基本没有影响。应用全细胞膜片钳技术,就苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ不同比例（3∶1,1∶1,1∶3）混合物对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫离体培养神经细胞钠离子通道的影响进行了比较。结果表明：苦皮藤素Ⅳ和苦皮藤素Ⅴ的不同比例混合物对钠通道（TTX-S）电流作用与二者所占比例有关,苦皮藤素Ⅳ比例大,表现出苦皮藤素Ⅳ对通道的阻滞效应,钠电流被抑制; 苦皮藤素Ⅴ比例大,则表现出对通道的激活,钠电流增大。另外,两者不同比例混合物对钠通道（TTX-S）电流的激活电压无明显影响,但对峰值电压影响显著,可使其向正电位方向移动10～20 mV。这些结果说明苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ可能作用于一个相同的钠通道结合位点或别构偶联位点,二者对钠通道的作用是一种拮抗作用。     

苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ对棉铃虫幼虫神经细胞钠通道的影响

电压门控钠通道是神经细胞兴奋传导的基础,也是杀虫剂最主要的作用靶标。具有二氢沉香呋喃多元酯骨架的苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ是卫矛科植物苦皮藤的主要杀虫活性成分,苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ处理后昆虫的中毒症状分别表现为麻醉和兴奋。本实验应用全细胞膜片钳技术就苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫离体培养神经细胞钠离子通道的影响进行了比较。结果表明：苦皮藤素Ⅳ对TTX-敏感钠通道电流的抑制明显具有浓度和时间依赖性,高浓度（10 μmol/L和1 μmol/L）条件下,峰值电流迅速减小而被抑制,在较中间浓度（0.1 μmol/L）时缓慢降低,而在低浓度（0.01 μmol/L）下,峰值电流先增加然后再缓慢降低;苦皮藤素Ⅳ对激活电压无明显影响,但使峰值电压向正电位方向移动,在高浓度移动迅速,低浓度移动缓慢。苦皮藤素Ⅴ对TTX-敏感钠通道电流峰值有明显的增大作用,也有一定的浓度依赖性;对激活电压无明显影响,峰值电压在高浓度下变化不明显,在较低浓度(0.1 μmol/L和 0.01 μmol/L)下向正电位方向移动明显。结果说明,苦皮藤素Ⅳ和Ⅴ可能在钠通道上有一个相同的靶标位点,但由于它们化学结构上的差异,可能对钠通道动力学的修饰 不同,导致不同的生理效应,昆虫表现出不同的神经中毒症状。     

苦皮藤素V对东方粘虫中肠V-ATP酶AB亚基复合物水解ATP活性的抑制作用

苦皮藤素V是一种对昆虫具有毒杀活性的化合物,从植物苦皮藤（Celastrus angulatus Max）中分离出来。目前,已发现苦皮藤素V可与粘虫中肠液泡型ATP酶（V-ATPase）的H、B和a亚基结合,但是其具体作用机理还尚不清楚。本研究将大肠杆菌(Escherichia coli)中表达得到的东方粘虫中肠V-ATPase A亚基突变体TSCA和V-ATPase B亚基包涵体洗涤、溶解后进行复性,获得可溶性AB亚基复合物后采用亲和层析纯化。将纯化好的AB亚基复合物测定H+K+-ATPase活性,证明其有ATP水解活性。随后,测定苦皮藤素V对复合物ATPase的抑制活性,发现加入苦皮藤素后,复合物ATPase活性降低。因此,其可能是通过抑制了AB亚基复合物的ATPase活性,从而产生了杀虫效果,证明AB亚基复合物为苦皮藤素V的潜在靶点之一。这为了解苦皮藤素与V ATPase相互作用机制打下了基础,也为进一步开发新型杀虫药物奠定了基础。     

苦皮藤素V对东方粘虫中肠V-ATP酶AB亚基复合物水解ATP活性的抑制作用北大核心CSCD

苦皮藤素V是一种对昆虫具有毒杀活性的化合物,从植物苦皮藤(Celastrus angulatus Max)中分离出来。目前,已发现苦皮藤素V可与粘虫中肠液泡型ATP酶(V-ATPase)的H、B和a亚基结合,但是其具体作用机理还尚不清楚。本研究将大肠杆菌(Escherichia coli)中表达得到的东方粘虫中肠V-ATPase A亚基突变体TSCA和V-ATPase B亚基包涵体洗涤、溶解后进行复性,获得可溶性AB亚基复合物后采用亲和层析纯化。将纯化好的AB亚基复合物测定H^+K^+-ATPase活性,证明其有ATP水解活性。随后,测定苦皮藤素V对复合物ATPase的抑制活性,发现加入苦皮藤素后,复合物ATPase活性降低。因此,其可能是通过抑制了AB亚基复合物的ATPase活性,从而产生了杀虫效果,证明AB亚基复合物为苦皮藤素V的潜在靶点之一。这为了解苦皮藤素与VATPase相互作用机制打下了基础,也为进一步开发新型杀虫药物奠定了基础。     

三种植物源杀虫活性成分对东方粘虫中肠细胞的毒力测定

采用MTT([3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基]四氮唑溴盐)比色法、中性红摄取法和台盼蓝拒染法,分别测定植物源杀虫活性成分苦皮藤素Ⅴ、白鲜碱和梣皮酮对中肠细胞的毒力。结果表明:急性分离的东方粘虫中肠细胞能在Grace’s昆虫细胞培养基中维持生长;3种供试药剂对中肠细胞均有明显的细胞毒性。MTT比色法、中性红摄取法和台盼蓝拒染法测得苦皮藤素Ⅴ对中肠细胞的LC50依次为9.0,7.79和10.94μg/mL;白鲜碱为27.85,31.77和36.42μg/mL;梣皮酮为186.66,164.00和192.34μg/mL。     

武汉城区四种不同水质对雷氏黄萤幼虫呼吸行为的影响

选择武汉城区4种不同的水质作为影响因子,通过室内实验,研究武汉城区4种不同水质对雷氏黄萤Luciola leii Fu and Ballantyne幼虫呼吸行为的影响,探讨利用雷氏黄萤幼虫的呼吸指标作为监测多污染源混合废水的可行性。结果表明,Ⅲ类(东湖)、Ⅳ类(汤逊湖)、Ⅴ类(野芷湖)和劣Ⅴ类(南湖)四类水质与CK相比较,对雷氏黄萤幼虫昼夜的呼吸行为均有影响。雷氏黄萤幼虫刚接触Ⅲ类、Ⅳ类、Ⅴ类和劣Ⅴ类水质均有明显反应。在劣Ⅴ类水质条件下,雷氏黄萤幼虫的呼吸持续时间和呼吸频率(FR)均高于Ⅲ类、Ⅳ类、Ⅴ类水质,呼吸间隔时间(SI)均低于Ⅲ类、Ⅳ类、Ⅴ类水质。提示雷氏黄萤幼虫的昼夜呼吸行为、呼吸持续时间、呼吸频率(FR)、呼吸间隔时间(SI)可作为多污染源混合废水的敏感生物学监测指标。     

Bacillus thuringiensis: a biotechnology model

This paper is on the different biotechnological approaches that have been used to improve Bacillus thuringiensis (Bt) for the control of agricultural insect pests and have contributed to the successful use of this biological control agent; it describes how a better knowledge of the high diversity of Bt strains and toxins genes together with the development of efficient host-vector systems has made it possible to overcome a number of the problems associated with Bt based insect control measures. First we present an overview of the biology of Bt and of the mode of action of its insecticidal toxins. We then describe some of the progress that has been made in furthering our knowledge of the genetics of Bt and of its insecticidal toxin genes and in the understanding of their regulation. The paper then deals with the use of recombinant DNA technology to develop new Bt strains for more effective pest control or to introduce the genes encoding partial-endotoxins directly into plants to produce insect-resistant trangenic plants. Several examples describing how biotechnology has been used to increase the production of insecticidal proteins in Bt or their persistence in the field by protecting them against UV degradation are presented and discussed. Finally, based on our knowledge of the mechanism of transposition of the Bt transposon Tn4430, we describe the construction of a new generation of recombinant strains of Bt, from which antibiotic resistance genes and other non-Bt DNA sequences were selectively eliminated, using a new generation of site-specific recombination vectors. In the future, continuing improvement of first generation products and research into new sources of resistance is essential to ensure the long-term control of insect pests. Chimeric toxins could also be produced so as to increase toxin activity or direct resistance towards a particular type of insect. The search for new insecticidal toxins, in Bt or other microorganisms, may also provide new weapons for the fight against insect damage.     

Blockage of chloride channels and anion transporters with pesticidal natural products and their synthetic analogs

Ligand-gated chloride channels mediate a variety of functions in excitable membranes of nerve and muscle in insects, and have a long history as targets for neurotoxic insecticides. Recent findings from our laboratory confirm that the natural product silphinenes and their semi-synthetic analogs share a mode of action with the established ligand-gated chloride channel antagonist, picrotoxinin. The silphinenes are non-selective, being roughly equipotent on insect and mammalian receptors, but also possess lethal and neurotoxic effects on a dieldrin-resistant strain of Drosophila melanogaster. These findings suggest that silphinenes act on insect GABA receptors in a way that is different from picrotoxinin, and it is possible that resistant insect populations in the field could be controlled with insecticidal compounds derived from the silphinenes. Voltage-gated chloride channels and anion transporters provide additional classes of validated targets for insecticidal/nematicidal action. Anion transporter blockers are toxic to insects via an action on the gut, and RNAi studies implicate voltage-gated chloride channels in nematode muscle as another possible target. There was no cross resistance to DIDS in a dieldrin-resistant strain of Drosophila melanogaster, and no evidence for neurotoxicity. The potent paralytic actions of anion transporter blockers against nematodes, and stomach poisoning activity against lepidopteran larvae suggests they are worthy of further investigation as commercial insecticidal/nematicidal agents.