鸭疫里默氏杆菌Mtan对底物SAH的催化活性

【目的】分析鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)不同血清型pfs基因的序列差异,并开展其编码蛋白S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Mtan,又称Pfs)的催化活性研究。【方法】PCR扩增9株不同血清型RA的pfs基因,分析其核苷酸序列的同源性;构建该基因的重组表达载体p Cold-RA-pfs,表达、纯化RA的重组蛋白Mtan(RA-Mtan);测定RA-Mtan对底物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)的催化活性,运用哈维弧菌报告菌株BB170检测催化底物的自诱导物2(Autoinducer-2,AI-2)活性。【结果】对RA的pfs序列分析结果表明,不同血清型RA的核苷酸一致性在93.9%-100%之间;SDS-PAGE检测结果表明,RA-Mtan呈可溶性表达;酶活测定表明RA-Mtan和禽致病性大肠杆菌(Avain pathogenic Escherichia coli,APEC)的Lux S蛋白共同作用于底物时,可产生浓度为176.7μmol/L的同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY);AI-2活性检测结果表明,产生的AI-2具有生物学活性。【结论】RA不同血清型的pfs高度保守,RA pfs基因的编码产物RA-Mtan在体外具有催化SAH的活性,RA-Mtan和禽致病性大肠杆菌的Lux S蛋白共同作用于底物SAH时,能产生有活性的AI-2,为进一步研究pfs对RA的调控作用提供参考。     

甘草次酸调节BLM的转录及PC3细胞的增殖凋亡和迁移侵袭

[目的]探究甘草次酸(GA)影响前列腺癌(PC3)细胞BLM基因的转录以及细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的情况。[方法]MTT法检测细胞增殖能力并筛选适宜的药物浓度,荧光定量PCR检测BLM基因的表达量,划痕法检测细胞迁移,Transwell小室检测细胞侵袭,流式细胞仪检测细胞凋亡。[结果]甘草次酸浓度在0.12 mol/L~0.36 mol/L范围时,随着浓度增大,细胞的增殖能力逐渐下降,呈现药物浓度梯度依赖性;当甘草次酸浓度为0.2 mol/L时,PC3细胞中BLM的mRNA的表达量仅有对照组的0.2倍;甘草次酸浓度在0.10 mol/L以上时,细胞的侵袭和迁移能力均显著减小;流式结果显示甘草次酸浓度在0.10 mol/L时,细胞凋亡率为45.25±0.5**,差异极显著(P0.01)。[结论]甘草次酸浓度为0.15 mol/L以上时,能够下调PC3细胞中BLM基因的转录量(P0.01),在0.12 mol/L~0.36 mol/L范围时,对PC3细胞的增殖、侵袭、迁移具有抑制作用,对PC3细胞凋亡具有促进作用。     

信号分子AI-2的体外合成及其对副溶血性弧菌四环素耐药性的调控作用

【背景】抗菌药的过度使用引起细菌耐药性日益严重,作为重要的食源性致病菌,副溶血性弧菌也表现出一定程度的耐药性。群体感应系统可以调控细菌的耐药性,为研究副溶血性弧菌的耐药机制和控制技术提供新的途径。【目的】探讨群体感应信号分子AI-2 (autoinducer-2)对海产品中分离的副溶血性弧菌四环素耐药性的调控作用。【方法】通过原核表达制备AI-2合成关键酶——S-核糖同型半胱氨酸酶(S-ribosylhomocysteinase, LuxS)和S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteinenucleosidase,Pfs),体外合成AI-2,通过菌落计数法分析AI-2对副溶血性弧菌在四环素亚抑菌浓度下耐受性的影响,采用逆转录实时荧光定量PCR法测定不同浓度AI-2对副溶血性弧菌四环素耐药基因转录水平的影响。【结果】通过原核表达获得LuxS和Pfs,作用于底物S-腺苷同型半胱氨酸能合成具有生物活性的AI-2,其荧光强度约为阳性对照的6倍。在四环素亚抑菌浓度下,AI-2能显著促进副溶血性弧菌的生长,6、15、30μmol/L浓度AI-2能不同程度地提高副溶血性弧菌四环素耐药基因的转录水平。【结论】AI-2能增强副溶血性弧菌对四环素的耐受作用,为解析副溶血性弧菌的耐药机制、研制以AI-2为靶点的副溶血性弧菌耐药性控制技术提供基础。     

白藜芦醇对猪前体脂肪细胞凋亡的作用及机理

旨在研究白藜芦醇对猪前体脂肪细胞凋亡的作用,探讨其分子机制。以50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L白藜芦醇处理猪前体脂肪细胞,采用Hoechst 33258染色剂染色,光学和荧光显微镜分别观察细胞的形态学变化。semi-qRT-PCR和Western blotting方法检测凋亡相关基因sirt1、caspase-3、bcl-2、bax、p53、NF-κB的mRNA和蛋白的表达变化。结果表明,白藜芦醇处理后,前体脂肪细胞出现明显的细胞凋亡,伴随细胞体积缩小,染色质凝集,核质固缩等特征显现,与对照组相比200 μmol/L处理组细胞的凋亡率显著升高 (P＜0.05)。凋亡相关基因sirt1、caspase-3和bax的mRNA和蛋白表达水平显著上调 (P＜0.05),而bcl-2、p53、NF-κB等基因的表达水平明显下调 (P＜0.05)。进一步证实白藜芦醇特异性地增加sirt1的表达活性,而sirt1的上调影响caspase-3和bcl-2家族因子的活性,同时参与调控p53和NF-κB的转录表达。因此,推测sirt1调控凋亡相关因子表达是白藜芦醇诱导前体脂肪细胞凋亡的关键原因。     

贝母提取物对异丙肾上腺素诱导心肌H9c2细胞肥大的干预作用

目的: 研究贝母提取物(FE)对异丙肾上腺素(Iso)诱导H9c2 心肌细胞肥大(CH)的干预作用。方法: 采用体外培养心肌H9c2 细胞,MTT法测定心肌H9c2细胞存活率; 细胞分4组(n=10):对照组、2 μmol/L Iso (模型)组、2 μmol/L Iso+FE 400 μg/L 组、2 μmol/LIso+FE 1 000 μg/L 组;相差显微镜观察细胞形态及测定心肌细胞直径;二辛可酸法检测细胞总蛋白;钙-4 试剂检测细胞内钙离子浓度。结果: Iso 组心肌H9c2细胞直径、总蛋白量及[Ca²⁺]i均显著高于对照组(P＜0.01);400 μg/ml 和1 000 μg/ml FE各组心肌H9c2细胞直径、总蛋白量及细胞[Ca²⁺]i均显著低于Iso组 (P＜0.05 或P＜0.01)。结论: FE对Iso诱导H9c2 CH有干预作用,可能与抑制钙信号通路激活有关。     

副溶血弧菌VPA1045和VPA1049调节Hcp2蛋白转位

[目的]副溶血弧菌通过分泌多种毒力因子引起急性胃肠炎,其中Ⅵ型分泌系统(T6SS1和T6SS2)是近年来新发现的一种毒力因子分泌系统,但该系统如何受到调控的、如何影响细胞粘附等问题在副溶血弧菌中尚不清楚.本研究的目的是为了阐明副溶血弧菌调控因子VPA1045和VPA1049对T6SS2分泌系统在转录、翻译和翻译后水平的调控作用.[方法]利用同源重组方法构建Vpa1045和Vpa1049缺失株,荧光定量方法检测T6SS2转位因子hcp2的转录水平差异,免疫印迹分析细菌菌体中Hcp2的表达与上清中Hcp2的跨膜转位差异.[结果]副溶血弧菌VPA 1045和VPA1049的基因结构中均含有Che-Y结构域,属于二元调控因子的反应调节因子.缺失Vpa1045和Vpa1049后,菌体中的Hcp2表达量和基因组中hcp2的转录水平差异不显著,细菌上清中的Hcp2转位量和对HeLa细胞的细胞粘附率与亲本株HZ相比显著下降.[结论]二元调控因子VPA1045和VPA 1049通过上调Hcp2的转位量从而翻译后上调副溶血弧菌T6SS2.     

产志贺毒素大肠杆菌O18 XZ113 株主要毒力基因eaeA、stx2、ehxA 突变株的构建及其对小鼠的致病作用

[目的]探讨毒力基因eaeA、stx2、ehxA与产志贺毒素大肠杆菌O18致病力的关系.[方法]利用λ-Red重组系统,构建STEC XZ113株eaeA、stx2、ehxA基因缺失突变株并进行一系列生物学特性的研究.[结果]细胞粘附试验表明突变株XZ113△eaeA对HEp-2细胞的粘附能力明显降低;Vero细胞毒素试验表明突变株XZ113 △stx2失去了使Vero细胞发生病变的能力;溶血活性试验表明突变株XZ113△ehxA无法在血平板上产生溶血圈,丢失了溶血能力.回复株在以上表型方面与野生株XZ113一致;与亲本株的体外竞争试验结果表明,突变株竞争力减弱,体内竞争结果表明突变株XZ1 13△eaeA被中度致弱;突变株XZ113 △stx2和突变株XZ113△ehxA被高度致弱.[结论]stx2、ehxA基因在STEC O18 XZ113株的致病过程中发挥着更为重要的作用.     

Sal B对肝癌细胞株HepG2的促凋亡作用

目的揭示丹酚酸B(Salvianolic Acid B,Sal B)对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。方法用不同浓度的丹酚酸B处理HepG2细胞,37℃培养24h。用RT-PCR检测促凋亡基因Bax的转录水平,并用流式细胞术检测细胞凋亡的水平。结果①100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L等浓度的Sal B处理都能使HepG2细胞促凋亡基因bax的转录水平升高,其中100μmol/L处理组最为明显。②不同浓度的Sal B处理都能使HepG2细胞发生凋亡,其中100μmol/L处理组最为明显。结论 Sal B有促进HepG2细胞凋亡的作用。     

Cd2+对三角褐指藻生长及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达调控的影响

为了探究Cd2+对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生长及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)基因表达调控的影响, 研究以不同浓度Cd2+处理三角褐指藻, 测定其生长、叶绿素荧光参数、UGP基因转录水平、UGPase活性和金藻昆布多糖含量等指标。结果表明: 低浓度(0.1 μmol/L)Cd2+促进三角褐指藻生长, UGP基因转录水平、UGPase活性和金藻昆布多糖含量分别比对照组提高了100.65%、11.99%和9.77%;而高浓度Cd2+处理组(2和5 μmol/L)各指标均显著降低, UGP基因转录水平较对照组分别下调了50.31%和60.47%, UGPase活性降低56.27%和66.72%, 金藻昆布多糖含量减少42.41%和47.30%。研究首次探究了Cd2+对三角褐指藻UGP基因表达的影响, 表明低浓度Cd2+促进三角褐指藻生长, 上调UGP基因表达, 提高金藻昆布多糖含量, 为Cd2+调控UGP基因的表达提供理论指导。     

大蒜阿霍烯抗胃癌的作用及分子机制*

目的: 探讨大蒜阿霍烯对胃癌细胞MGC-803的作用及相关分子机制。方法: 终浓度分别为0、1、5、25和125 μmol/L大蒜阿霍烯作用于细胞MGC-803 24 h、48 h和72 h,各设3复孔,MTS法检测细胞增殖活性,JC-1和Hoechst染色法观察线粒体膜电位和核型改变,LDH释放法检测细胞毒性,流式法分析细胞的凋亡和周期改变,RT-qPCR和Western blot检测P53、Caspase-3、RAS、ERK、BCL-2、AKT、mTOR、PI3K基因的表达,同时,取4周龄雄性BALB/C鼠随机分成5组,20只/组,腹股沟皮下接种胃癌细胞MGC-803,2 d后各组分别经皮下注射浓度为0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、125 μmol/L的大蒜阿霍烯,0.1 ml/次,隔天注射一次,并于首次注射肿瘤细胞的第20日每组杀10只,取瘤组织,称重。记录剩余小鼠的存活期,观察大蒜阿霍烯对荷瘤小鼠胃癌生长及生存期的影响。结果: 大蒜阿霍烯可明显抑制MGC-803细胞增殖活性,诱导细胞凋亡(P＜0.01),显著上调P53、Caspase-3、BAX基因的转录和表达水平,抑制基因RAS、ERK1、BCL-2、AKT、mTOR和PI3K的表达(P＜0.01),显著抑制小鼠胃癌移植瘤生长,并延长荷瘤小鼠存活期(P＜0.01)。结论: 大蒜阿霍烯对胃癌有治疗作用,可通过调节PI3K-AKT-mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK信号通路而抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。