具杀线虫活性植物内生细菌的筛选和活性产物

【目的】植物寄生线虫是危害植物的重要病原物,为了筛选到能在植物体内稳定定殖并且对植物寄生线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌生防菌。【方法】以松材线虫为靶标,用直接触杀法进行筛选。对高活性菌株采用正交实验优化发酵条件,测定发酵液杀线虫活性的稳定性,并对菌株进行鉴定。【结果】从6种植物中分离筛选出13株对松材线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌菌株,这些菌株的发酵上清液对松材线虫处理24h杀线虫率均达到了100%;其中BCM2、SZ5、CCM7和DP1这4个菌株的杀线虫活性较高,发酵上清液稀释3倍处理24h杀线虫率均达到95%以上,DP1和SZ5菌株达到了100%;并发现部分菌株发酵液能使线虫虫体发生渗漏或消解。发酵条件优化后能使发酵液杀线虫效果提高4倍。4株高活性菌株产生的杀线虫物质均对蛋白酶稳定、耐热不耐酸碱且长时间保藏活性不下降。经过鉴定DP1和CCM7是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),BCM2和SZ5是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】经济作物体内存在一定数量的能产生杀线虫活性物质的内生细菌,其中一些细菌产生的杀线虫物质具有较强的稳定性。认为杀线虫活性的植物内生细菌具有很大的生防潜力。     

线虫生防细菌W3对线虫侵染活性的测定

目的:筛选以体壁穿透方式进入线虫体内而引起宿主致病的杀线虫细菌,为开发新的植物寄生线虫生防战略奠定基础.方法:通过毒性测试和平板法筛选杀线虫细菌,利用显微镜和扫描电镜研究观察细菌对线虫的作用方式和侵染过程.结果:筛选获得的杀线虫细菌菌株W3具有明显的侵染活性.生测结果表明,细菌培养上清液和上清蛋白粗提物对腐生线虫致死率分别达到95%和100%.在平板测试中,测试线虫体壁被严重破坏,在48h内超过80%的线虫被杀死和降解.扫描电镜观察可以明显的看到细菌穿透线虫体壁后在线虫体壁上留下的孔.结论:细菌W3具有显著的杀线虫活性和线虫体壁降解活性,其杀线虫活性物质主要存在于细菌培养上清液中.     

相似穿孔线虫拮抗细菌的筛选及分子鉴定

【背景】相似穿孔线虫是一种重要的检疫性有害生物,其寄主范围广,危害具有毁灭性,已给我国农业生产造成潜在威胁。由于目前大多化学杀线剂毒性较高,筛选获得对相似穿孔线虫具有拮抗活性的微生物菌株对线虫防控具有重要意义。【方法】广泛从染病香蕉植株根际采集土壤样本,运用等比稀释涂布平板法分离菌株;采用摇瓶发酵法制备拮抗菌株上清液和发酵液。通过室内生物测定和盆栽试验,筛选出对相似穿孔线虫具有拮抗作用的细菌菌株,并通过16S rDNA的PCR扩增和序列分析,对拮抗菌株进行种类鉴定。【结果】获得5株对相似穿孔线虫具有较理想拮抗活性的细菌菌株。其中,菌株HD-86的作用效果最好,其发酵上清液处理24 h后的相似穿孔线虫死亡率达100%。盆栽试验表明,菌株HD-86发酵液处理42和70 d后对相似穿孔线虫的相对防效分别为77.34%和90.51%,均优于对照药剂阿维菌素。【结论与意义】菌株HD-86对相似穿孔线虫具有很强的拮抗作用,将其鉴定为洋葱伯克氏菌Burkholderia cepacia。本研究可为相似穿孔线虫生防制剂的研发和病害的防控提供依据。     

松材线虫生防细菌的筛选、鉴定及其毒性因子的初步研究

从河南南阳不同农田的植物根部采取土壤样本,共分离获得了198株细菌。通过毒性测试和平板生测从中筛选出松材线虫生防细菌6株,其中NS-3菌株对松材线虫的杀灭活性最高。结合该菌株的形态学、生理学特征及16S rDNA序列分析等结果将该菌株归为芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.strain NS-3。将该细菌液体培养的上清液和上清蛋白粗提物分别处理松材线虫48h后线虫的死亡率分别达到50%和100%;线虫死亡后虫体消解。然而,细菌的上清蛋白粗提物经煮沸变性后,基本丧失了对松材线虫的侵染活性,结果显示细菌Bacillus sp.strain NS-3的杀线虫活性物质主要要存在于细菌培养上清液中,并且为热不稳定性物质。     

茎瘤固氮根瘤菌甲基化受体蛋白Tlp1的功能

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌中趋化基因簇上游的受体蛋白Tlp1编码基因的突变表型,初步探究其功能机理。【方法】利用同源重组和三亲本接合转移的方法构建突变株,在TY培养基中测定生长情况,半固体平板法观察趋化圈,刚果红固体培养基观察胞外多糖和次生代谢产物的分泌,乙炔还原法测定菌株的固氮酶活性。【结果】与野生型菌株相比,tlp1突变株的生长速率没有影响。在以甘油为碳源的L3半固体平板上突变株的趋化圈变小,其回补菌株能部分回补趋化能力。突变株的胞外多糖分泌与野生型没有区别,但其次生代谢产物黑色素出现的时间比野生型稍早。在固氮酶活性测定中,发现突变株酶活性明显比野生型降低,回补菌株能够部分回补。【结论】茎瘤固氮根瘤菌Tlp1蛋白对甘油表现出一定的趋化能力,并且影响细菌的次生代谢产物和固氮能力。     

碳代谢基因gabT调控生防菌Snea253的γ-氨基丁酸代谢途径影响杀线虫活性

【背景】委内瑞拉链霉菌Snea253是本实验室前期获得的具有杀植物线虫活性的生防放线菌,通过生物信息学分析,γ-氨基丁酸转氨酶基因(gabT)是参与Snea253碳代谢的重要基因之一。【目的】明确gabT基因通过调控Snea253的γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)代谢通路,从而影响菌株的活性。【方法】以紫外诱变所得弱毒株(Snea253-R)为材料,以南方根结线虫为靶标,在弱毒株中过表达gabT基因,通过酶联免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)分别检测菌株中GABA和下游代谢产物琥珀酸的含量及杀线虫活性,同时检测在不同碳源培养条件下野生型菌株gabT基因表达水平、产物含量和杀线虫活性。【结果】过表达菌株R-p IB139的gabT基因上调表达,GABA含量降低,琥珀酸含量升高,杀线虫活性提高了39%;在8种不同碳源培养条件下,gabT基因在野生株中相对表达量较高的培养基碳源是可溶性淀粉和玉米淀粉,其发酵液中GABA含量较低,发酵液中下游代谢产物增多,杀线虫活性较高。【结论】通过改变gabT基因的表达,明确GABA支路在调控Snea253代谢以提高杀线虫的过程中发挥重要作用。     

沙棘根瘤内生细菌中抑菌促生菌株的筛选和鉴定

【背景】植物内生细菌可产生具有抑菌和促生活性的物质,既能抑制植物病原菌对寄主植物的侵染,也能促进植物的生长。沙棘根瘤内生细菌是根瘤内除共生固氮的弗兰克氏菌外,与沙棘共生的一大类微生物。研究具有抑菌和促生活性的植物内生菌,可为微生物菌肥的研究提供理论基础。【目的】筛选具有优良抑菌和促生活性的沙棘根瘤内生细菌,初步研究其抑菌和促生活性,并对菌株进行鉴定。【方法】采用双层琼脂法、琼脂扩散法、双层平板对峙法、牛津杯法进行沙棘根瘤拮抗性内生细菌的筛选。选取抑菌活性较高的内生细菌,分别采用Salkowski比色法、ChromeAzurolS(CAS)平板检测法和钼锑抗比色法进行产吲哚乙酸、铁载体及溶磷能力的测定。采用发酵液灌根法测定沙棘根瘤内生细菌SR308对黄瓜促生作用的盆栽效果。通过形态和培养特征、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析法对菌株TT201和SR308进行鉴定。【结果】从131株沙棘根瘤内生细菌中筛选出9株具有较强抑菌活性的内生细菌,其中菌株TT201抑菌性最佳、抑菌谱广;菌株SR308的促生活性最好,其发酵液对黄瓜的生长具有较强的促进作用。对具有较强抑菌和促生活性的菌株TT201和SR308进行鉴定的结果表明,菌株TT201为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus),菌株SR308为蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)。【结论】获得2株具有优良抑菌和促生活性的沙棘根瘤内生细菌,为进一步开发微生物农药及菌肥提供了资源。     

不同碳源对生防荧光假单胞菌2P24产抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚的影响

【目的】包括碳源代谢等不同环境因子可调控生防菌株生防相关因子表达,进而影响其防病效果。荧光假单胞菌2P24可防治多种植物病原真菌、细菌引起的土传病害,抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphoroglucinol,2,4-DAPG)是其主要生防因子之一。本文利用平板对峙法及遗传学方法研究不同碳源对菌株2P24产生2,4-DAPG的影响及相关的调控途径。【方法】利用平板对峙法检测了菌株2P24在添加葡萄糖、果糖和蔗糖等碳源的土豆浸液培养基中对棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的拮抗能力及菌株2P24中影响2,4-DAPG产生的相关基因的表达。另外,利用Tn5转座子对含有2,4-DAPG合成基因phl A报告质粒p970Gm-phl Ap的野生型菌株2P24进行随机突变,在果糖土豆浸液培养基中筛选提高phl A基因表达的突变菌株。【结果】平板对峙实验表明,菌株2P24以葡萄糖为碳源时其抑菌活性最强,蔗糖次之,而以果糖等为碳源时菌株2P24无抑菌活性;转录融合实验进一步表明葡萄糖可促进phl A基因的表达,果糖则不影响phl A基因的表达。在果糖土豆浸液培养基中,转座子随机突变实验获得了5株可明显提高phl A基因表达的突变菌株。Tn5插入位点和序列分析显示其中一个突变体是Tn5破坏了che B基因。转录检测表明与野生菌株相比,che B突变体中phl A基因的表达和2,4-DAPG的前体物质间苯三酚(phloroglucinol,PG)产量都显著提高。游动性实验发现突变che B基因可显著降低该菌株的游动性。【结论】上述结果表明菌株2P24中不同碳源在转录水平上可影响phl A基因的表达,进而影响2,4-DAPG产生。遗传学结果也显示,che B基因参与调控2,4-DAPG生物合成过程。     

一株北里孢菌株的分离鉴定及其对松材线虫的致病性

【目的】筛选、鉴定出对松材线虫杀灭活性较高的放线菌菌株,并确定生防菌株的毒力因子。【方法】采用平板活性测试及代谢杀虫活性检测方法进行筛选,采用形态学及16S rDNA序列分析等进行鉴定。对发酵液中的活性物质稳定性分析后,利用醇沉、萃取、层析、气相色谱/质谱分析等方法分离纯化出杀虫毒力因子。【结果】从河南南阳宝天曼的腐木及枯枝落叶样品中共分离获得了79株放线菌,从中筛选出对松材线虫有灭活作用的放线菌6株,其中分离株C620菌株对松材线虫的灭活性最高:该菌株的发酵液处理松材线虫48、60 h后线虫的死亡率分别达到60.0%、81.5%。结合该菌株的形态学、生理学特征及16S rDNA序列分析等结果将其归为北里孢菌属中的一个种,菌株编号Kitasatospora sp.strain C620。该菌株的发酵液中杀线虫活性物质的热稳定性、光稳定性及耐储藏性均较强,在中性偏碱性环境较稳定;经pH纸电泳层析初步确定该物质属于碱性水溶性物质。对菌株C620发酵液分离纯化,得到活性化合物为1-苯基-3-(2-吡啶)-5-吡唑啉酮。【结论】获得一株松材线虫高效生防菌Kitasatospora sp.strain C620,其活性物质为1-苯基-3-(2-吡啶)-5-吡唑啉酮。     

挥发性物质诱吸线虫的土壤细菌系统多样性特征及其活性挥发物鉴定

摘要:【目的】明确有机挥发物诱吸线虫的土壤细菌种群多样性及其活性挥发物,有助于了解线虫与土壤微生物间的互作关系,为利用诱吸性物质与杀线虫剂配合使用,提高防治寄生线虫效果奠定基础。【方法】通过双培养皿倒扣法筛选我国26 个省市的187 份农业土壤中挥发性诱吸线虫的细菌资源、测定其诱吸活性,并结合RFLP-16S rRNA 方法分析活性细菌的系统亲缘关系;采用SPME-GC /MS 方法鉴定其挥发物的类型,并通过纯品进行诱吸功能验证。【结果】从分离自187 份土样的3800 株细菌中,筛选出诱吸活性(AN)≥