沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因GdSP的克隆及对温度胁迫的响应

【目的】丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica丝氨酸蛋白酶基因,分析其对温度胁迫的响应,以期为进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的调控机制及其他生理功能奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲2龄幼虫转录组数据,采用RACE技术克隆得到沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;应用qPCR技术检测其在不同温度(-10,-5,0,5,25和35℃)下处理1 h后及25℃下恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】自沙葱萤叶甲克隆获得一个丝氨酸蛋白酶基因,命名为GdSP(GenBank登录号:MG797556)。该基因全长1 110 bp,开放阅读框969 bp,编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 kD,等电点5.61;编码蛋白具有丝氨酸蛋白酶的典型特征,具有一个跨膜结构,无信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdSP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高,氨基酸序列一致性为30.53%。qPCR测定结果表明,不同温度处理间2龄幼虫中GdSP表达量差异不显著,但对各高低温(-10℃除外)胁迫处理回温后GdSP表达量显著上升。【结论】快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响,而回温可诱导其上调表达。     

人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor的基因克隆与序列分析

目的:克隆得到人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因,并应用生物信息学方法进行序列分析。方法:提取HepG2细胞总RNA,RT-PCR扩增Hespintor基因片段,连接至pMD 20-T克隆载体中,转化JM109宿主菌,蓝白斑法筛选阳性克隆菌落,菌落PCR及测序鉴定。利用在线工具软件对Hespintor进行信号肽预测、亚细胞定位、结构域、三级结构、基因染色体定位及组织分布表达分析。结果:人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因全长285bp,共编码94aa,其中1-23aa编码信号肽,符合亚细胞定位于细胞外的预测;53-93aa编码一个典型的Kazal结构域。Hespintor基因的染色体定位于5号染色体短臂3区3带1亚带(5q33.1);正常组织中仅在睾丸有表达,而肿瘤组织中仅在生殖细胞瘤有表达。结论:Hespintor是一个在机体中静止表达的Ka-zal型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族的分泌型新成员。     

植物基因cDNA克隆新技术及进展

过去人们对植物基因的cDNA克隆主要集中在植物看家基因 (house keepinggene) ,而对植物发育调控基因 (developmentalregulatedgene)进行的cDNA克隆研究工作开展得比较少。随着近年来基因差异表达研究技术的飞速发展 ,已建立了好几种发育调控基因的cDNA克隆方法 ,如从较早的DD PCR到最近的cDNARDA、SSH和IPGI,着重论述了cDNARDA、SSH和IPGI的基本技术策略 ,并对三者之间进行了比较分析。     

2型糖尿病早期大鼠外周神经节基因表达谱分析

糖尿病神经病变(Diabetic neuropathy,DN)是糖尿病在神经系统发生的多种并发病变的总称。文章旨在筛选2型糖尿病早期大鼠外周神经节差异表达的基因。采用Illumina大鼠基因表达芯片,比较糖尿病模型与非糖尿病大鼠外周神经节基因表达谱差异。结果表明,全基因组12 604个已知基因中,158个基因差异表达。糖尿病组与非糖尿病组相比,87个基因表达上调,71个表达下调。对差异表达的基因进行GO分析,发现上调基因所参与的最显著(P<0.001)的几个生物学过程都与神经细胞骨架及运动功能有关;下调基因所参与的最显著的生物学过程主要与"对病毒/生物刺激/其它生物的反应"有关。KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析显示,差异表达的基因所参与的最显著(P<0.001)的生物学通路为代谢通路。结果表明:高血糖可导致糖尿病大鼠外周神经节代谢紊乱;高血糖可能通过免疫炎症反应、改变神经细胞骨架及运动功能相关的基因的表达,继而损害外周神经节的结构和功能。     

绵羊CAST基因2型和4型转录本的克隆及特性分析

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)是一种内源性的需要Ca²⁺激活的钙蛋白酶抑制剂, 在肌肉组织的蛋白质降解过程中起重要的调节作用。文章利用牛^CAST基因的mRNA序列, 通过逆转录RT-PCR首次克隆获得绵羊CAST基因2型转录本和4型转录本的部分cDNA序列, 并对序列进行生物信息学分析。CAST基因2型转录本的扩增片段为4 385 bp, 完整的开放阅读框为2 361 bp, 编码786个氨基酸; CAST基因4型转录本的扩增片段为1 467 bp, 完整的开放阅读框为1 317 bp, 编码438个氨基酸。CASTⅡ型蛋白序列存在4个保守结构域, CASTⅣ型蛋白序列存在3个保守结构域; 两者的二级结构均以螺旋为主, 富含疏水区域, 其氨基酸序列存在多个磷酸化位点以及蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)的磷酸化位点。通过RT-PCR分析CAST基因2型转录本和4型转录本的组织表达谱, 结果表明CAST基因2型转录本在所检测的10个组织中均表达, CAST基因4型转录本仅在睾丸组织中表达。     

甜荞FeFUL2基因的克隆与表达分析

为了探索甜荞FUL同源基因参与花与籽粒发育调控的分子机制,该文采用同源克隆的方法从甜荞(Fagopyrum esculentum)长花柱和长雄蕊突变体(lpls)中克隆到1个长837 bp的FeFUL2基因(GenBank登录号为MG779493.1),其包含长690 bp的完整开放阅读框,编码1个由229个氨基酸残基组成的MADS-box转录因子。通过对FeFUL2进行分子系统发生、同源蛋白比对与转录因子结构分析,结果显示FeFUL2与核心真双子叶植物AP1/FUL亚家族转录因子中的euFUL进化系聚于1个进化分支,属甜荞euFUL型MADS-box转录因子,且包含1个57个氨基酸残基长的高度保守的MADS结构域、1个69个氨基酸残基长的次级保守的K结构域,其C末端转录激活区在序列长度和氨基酸残基组成上与其他euFUL型转录因子差异较大,但仍含有2个euFUL型转录因子特有的保守基元:FUL motif和paleo AP1 motif。用qPCR检测基因表达的组织特异性显示:FeFUL2基因在甜荞lpls突变体的根、茎、叶、花被片、雄蕊、雌蕊和发育4 d的幼果中均有表达,但其在花被片中表达量极显著高于该基因在其他器官中的表达量(LSD,P0.01)。综合转录因子的结构与基因的表达模式推测,FeFUL2基因与其他euFUL型基因的功能可能存在一定差异,其在花发育过程中可能主要参与甜荞花被片的发育调控。     

利用生物信息学研究肥胖与2型糖尿病患者肝组织基因表达变化

目的:利用芯片数据分析工具对GEO基因芯片数据进行数据挖掘,系统分析肥胖与2型糖尿病患者肝组织相关基因表达的变化,探讨肥胖与2型糖尿病的联系及糖尿病早期预防和诊断的新靶点。方法:首先在公共芯片数据库中选择肥胖与2型糖尿病相关芯片数据(GSE15653),利用R等芯片数据分析工具分析肥胖与2型糖尿病患者肝组织基因的表达变化,并预测相关差异表达基因在血中蛋白表达。结果:肥胖患者与正常人肝组织比较发现412个差异表达基因,其中上调表达基因212个,下调表达基因200个,2型糖尿病患者中控制良好者与正常人肝组织比较发现486个差异表达基因,其中上调表达基因253个,下调表达基因233个,而2型糖尿病患者中控制不良者与正常人肝组织比较发现1051个差异表达基因,其中上调表达基因560个,下调表达基因491个;2型糖尿病控制良好者与肥胖患者肝组织有263个相同的表达变化基因,而2型糖尿病控制不良者与肥胖患者肝组织有131个相同的表达变化基因;结合蛋白质组学结果分析肥胖与2型糖尿病相关的差异表达基因中有30个蛋白表达产物是分泌型蛋白。结论:肥胖及2型糖尿病患者肝组织与正常肝组织比较基因表达均发生明显变化,其基因表达变化数目随疾病的严重性增加而增多,而且2型糖尿病的控制情况与肝组织基因表达变化有密切关系。肥胖与2型糖尿病相关的差异表达基因中表达分泌型蛋白的可进一步用于研发监测疾病发生发展的候选靶分子。     

不同海拔饲育的麦洼牦牛肺脏组织转录组学分析

为了探讨牦牛适应高海拔低氧环境的基因表达特征与规律,对在高海拔（3 560 m）和低海拔地区（478 m）饲育4个月的2.5~3岁健康雄性麦洼牦牛肺组织进行转录组测序。转录组测序采用Illumina高通量测序平台(HiSeqTM2500/4000)进行,并以qRT-PCR验证差异表达基因的表达量。结果显示,高海拔组牦牛肺脏转录组平均每个测序样本得到约5.76亿条Clean Reads,低海拔组牦牛中得到约6.10亿条Clean Reads,比对到参考基因组上的Reads数分别占91.74%和91.28%以上,共发现了2 047个新转录本。低海拔组与高海拔组牦牛肺脏组织之间共有199个差异表达基因,其中含89个差异上调表达基因和110个差异下调表达基因。所得差异表达基因富集在297个GO条目和146个KEGG通路中,包含62个低氧适应相关的GO条目和35个低氧适应相关代谢通路。其中低氧适应相关GO条目在生物过程、细胞组成和分子功能三种类别中占比最多的分别为细胞粘附、蛋白复合物和钙离子结合。低氧适应相关KEGG通路中占比最多的为肿瘤坏死因子(TNF)信号通路,其次为低氧诱导因子1(HIF-1)信号通路。qRT-PCR验证结果显示,Ⅱ类人类白细胞抗原α链(HLA-DOA、HLA-DRA)、补体因子 (C2)和甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1（MASP1）基因的表达量变化与转录组测序结果相符。本研究为全局和深入理解牦牛肺组织转录本表达对高海拔低氧的响应提供了有价值的切入点。     

一个大鼠心肌缺血-再灌诱导表达上调的新基因Mip1的克隆和特性分析

采用生物信息学方法和5′cDNA末端快速扩增法(RACE)技术相结合,克隆了一个大鼠心肌缺血-再灌诱导表达上调的新基因Mip1,并经RT-PCR测序及多组织膜RNA印迹证实.生物信息学分析显示,MIP-1定位于大鼠染色体1q12区,含5个外显子和4个内含子,开放阅读框(ORF)为1 827 bp,编码608个氨基酸,其编码蛋白N端含KRAB结构域,C端含14个连续的C2H2型锌指蛋白结构域,氨基酸第277位至293位为双向的核定位信号,多组织膜RNA印迹显示该基因在脑组织表达最高,其次是心脏,在其他组织表达较低或无表达.进一步深入研究该基因的功能具有重要生物学意义.     

人类新基因ZNF418的研究初报

根据计算机克隆的ZNF418基因序列设计引物,从人类胚胎心脏文库中克隆了一个人类新KRAB/C2H2型锌指基因,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF418。该基因位于染色体19 q13.43,编码蛋白由676个氨基酸残基组成的、含有1个KRAB框和17个连续排列的C2H2型锌指的蛋白质。Northern杂交的结果表明该基因在多种成人组织中表达;亚细胞定位研究证明ZNF418蛋白主要分布在胞核中。这些结果提示该基因编码一种潜在的转录因子。     

cDNA representational difference analysis of ileal Peyer's patches in lambs after oral inoculation with scrapie

cDNA representational difference analysis (RDA) was used to study gene expression profiles in the ileal Peyer's patch of a lamb 1 week after oral inoculation with the scrapie agent. Twenty-five differentially expressed cDNA fragments were identified and cloned. Sequence analysis indicated seven novel gene sequences. Other clones shared sequence homology with genes encoding ribosomal and mitochondrial proteins, the translation initiation factor EIF4GII and the bovine pancreatic thread protein. Reverse Northern was used to confirm the differential expression in another four lambs inoculated with scrapie and the tissue distribution of the novel genes was examined using Northern blot analysis.     

Gene expression profiling in maize roots under aluminum stress

To investigate the molecular mechanisms of Al toxicity, cross-species cDNA array approach was employed to identify expressed sequence tags (ESTs) regulated by Al stress in root tips of Al-tolerant maize (Zea mays) genotype Cat100-6 and Al-sensitive genotype S1587-17. Due to the high degree of conservation observed between sugarcane and maize, we have analyzed the expression profiling of maize genes using 2 304 sugarcane (ESTs) obtained from different libraries. We have identified 85 ESTs in Al stressed maize root tips with significantly altered expression. Among the up-regulated ESTs, we have found genes encoding previously identified proteins induced by Al stress, such as phenyl ammonia-lyase, chitinase, Bowman-Birk proteinase inhibitor, and wali7. In addition, several novel genes up-and downregulated by Al stress were identified in both genotypes.     

Identification of genes specifically expressed in the accumulated visceral adipose tissue of OLETF rats

The Otsuka Long-Evans Tokushima fatty (OLETF) rat is an animal model of type 2 diabetes, characterized by abdominal obesity, insulin resistance, hypertension, and dyslipidemia. To elucidate the underlying molecular mechanism of obesity and its related complications, we used representational difference analysis and identified the genes more abundantly and specifically expressed in the visceral adipose tissue (VAT) of obese OLETF rats compared with the diabetes-resistant counterpart, that is, Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rats. By Northern blot analysis, we confirmed the differential expression of 13 genes, including 3 novel genes. The upregulated expression of well-characterized lipid metabolic enzymes, such as lipoprotein lipase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, and cholesterol esterase, were observed in VAT of OLETF rats. We demonstrated the differential expression of secreted proteins in VAT of OLETF rats, such as thrombospondin 1 and contrapsin-like protease inhibitor. In contrast to lipid enzymes, the secreted proteins revealed exclusive mRNA expression and they were not detected in VAT of LETO rats. Furthermore, the novel genes OL-16 and OL-64 were also expressed specifically in VAT of OLETF rats and were absent in that of LETO rats and other tissues, including subdermal and brown adipose tissues. The C-terminal partial amino acid sequence of OL-64 revealed that it showed approximately 40% homology with alpha(1)-antitrypsin and it seemed to be a new member of the serine proteinase inhibitor (SERPIN) gene family. VAT of OLEFT rats had a unique gene expression profile, and the accumulated VAT-specific known and novel secreted proteins may play a role(s) in the pathogenesis of obesity and its related complications.     

Cloning, genomic organization, chromosomal assignment and expression of a novel mosaic serine proteinase: epitheliasin

We report the isolation of a cDNA encoding a novel murine serine proteinase, epitheliasin. The cDNA spans 1753 bp and encodes a mosaic protein with a calculated molecular mass of 53529 Da. Its domains include a cytoplasmic tail, a type II transmembrane domain, a low-density lipoprotein receptor class A domain, a cysteine rich scavenger receptor-like domain and a serine proteinase domain. The proteinase portion domain shows 46-53% identity with mouse neurotrypsin, acrosin, hepsin and enteropeptidase. The gene, located in the telomeric region in the long arm of mouse chromosome 16, consists of 14 exons and 13 introns and spans approximately 18 kb. Epitheliasin is expressed primarily in the apical surfaces of renal tubular and airway epithelial cells.     

基于PCR的cDNA基因克隆技术研究进展

RT-PCR、锚定PCR、cDNA末端快速扩增（RACE）、step out RACE、DDRT-PCR、cDNA代表性差异分析、抑制性削减杂交等都是建立在PCR基础之上的cDNA分子克隆技术。本介绍各种技术的优缺点、应用以及与同类技术进行比较,这些技术现在已经成功应用于大量EST的分离、cDNA库的构建、编码产物未知的差别表达基因的分离以及全长cDNA基因序列的克隆等方面。     

红色毛癣菌分泌性蛋白酶的分析

分泌性蛋白酶是红色毛癣菌致病的潜在毒力因子。在构建红色毛癣菌6个不同时间段cDNA文库的基础上,共获得了9683条uniqueESTs,通过生物信息学分析从中得到了18个可能的分泌性蛋白酶的EST序列,包括4个分泌性肽酶、1个分泌性金属蛋白酶、2个细胞外丝氨酸蛋白酶、1个分泌性天冬氨酸蛋白酶、9个分泌性枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、1个空泡丝氨酸蛋白酶。这些分泌性蛋白酶在红色毛癣菌感染过程中可能分别与其获得营养、扩大侵袭范围及激起宿主免疫应答有关,这些结果为进一步研究红色毛癣菌感染和发病机制提供了重要的分子基础和线索。