好氧反硝化聚磷菌的筛选及菌群构建优化

【背景】近年来,随着海水养殖规模的扩大,养殖产品产生的排泄物与残留的饲料大量积累,导致养殖水域的氮磷元素含量上升,水体富营养化加剧并对环境造成危害。【目的】从红树林人工湿地中筛选出好氧反硝化聚磷菌株并研究各菌株的最佳除氮除磷效率,随后通过响应面法构建菌群,进一步强化菌株去除污染物的能力。【方法】将前期筛选出的5株耐盐异养硝化-好氧反硝化菌通过异染颗粒染色和聚-β-羟基丁酸(poly-β-hydroxybutyricacid,PHB)染色进行好氧反硝化聚磷菌的筛选,通过单因素试验明确各菌株的最佳除氮除磷条件,并利用Design-Expert软件和Box-Benhnken响应面法进行配比试验。【结果】经过筛选获得3株耐盐好氧反硝化聚磷菌,分别为肺无色杆菌(Achromobacter pulmonis) strain E43、氧化木糖无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)strainJ1和食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)strain F2,发现菌株E43具有聚磷功能,确定了耐盐好氧反硝化聚磷菌群的最优降解投加比例为E43:J1:F2=1:1:...     

人工湿地反应性填料开发及其脱氮除磷性能研究

【目的】人工湿地填料作为反硝化电子供体可以高效且稳定地脱氮除磷,但是填料的选用方式和作用机理尚不明确。【方法】本文以磁黄铁矿、菱铁矿和农业废弃物(木屑等)为人工湿地填料,研究了其对人工湿地反硝化脱氮除磷的效果。【结果】结果显示,质量比1:1的矿石组合和木屑以3:1的质量比作为混合填料,驯化8个周期后NO₃^--N和PO₄^3--P的平均去除率达到88.6%和88.9%。扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)、X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)、X射线衍射仪(X-ray diffraction,XRD)和群落分析结果表明,微生物能有效利用矿石及其次生产物和木屑进行高效和持久的脱氮除磷,脱氮除磷功能菌硫杆菌(Thiobacillus)、罗姆布茨菌(Romboutsia)和溶杆菌(Lysobacter)得到了富集。【结论】本研究为人工湿地实际应用中新型填料的选择提供理论依据与指导意义。     

基于好氧反硝化及反硝化聚磷菌强化的低温低碳氮比生活污水生物处理中试研究

【背景】低碳氮比生活污水很难达标处理,多级A/O工艺、生物强化技术及生物膜技术的有机结合可有效解决这一问题。【目的】开发出一种泥膜共生多级A/O工艺并进行中试研究,驯化出高效脱氮除磷菌剂并对系统进行生物强化。【方法】通过测定中试设备出水及污水处理厂出水化学需氧量(Chemical oxygen demand,COD)、氨氮(NH_4~+-N)、硝氮(NO_3~--N)、总氮(Total nitrogen,TN)、总磷(Total phosphorus,TP)对比分析两种工艺的污染物去除效能,利用高通量测序技术对比生物强化技术对系统微生物群落结构的影响。【结果】中试设备对COD、NH_4~+-N、NO_3~--N、TN、TP的去除效果均优于污水处理厂的处理工艺;驯化的低温好氧反硝化菌TN去除率最大值可达84.21%,驯化的低温反硝化聚磷菌群对磷的去除率最高可达85.75%;利用驯化菌群对中试设备进行生物强化后较好地改善了系统NH_4~+-N、NO_3~--N、TN、TP的去除效果;经生物强化后,具有好氧反硝化和反硝化聚磷功能的Pseudomonas菌群明显增多。【结论】泥膜共生多级A/O工艺对于低碳氮比生活污水的处理具有很好的效果,利用生物强化技术可有效提高低温条件下系统污染物去除效能。     

反硝化聚磷菌及其脱氮除磷机理研究进展

水体富营养化是当前水环境保护工作的重点关注问题,微生物修复富营养化水体具有高效、低耗且不产生二次污染等特点,已经成为富营养化水体生态修复的一种重要方式。近年来,对反硝化聚磷菌的研究及其在污水处理工艺中的应用越来越广泛。不同于传统的反硝化细菌联合聚磷菌去除氮磷工艺,反硝化聚磷菌在交替厌氧、缺氧/好氧条件下能同时进行脱氮除磷而被广泛关注与研究。值得注意的是,近几年报道的部分微生物仅在好氧条件下就可进行同时脱氮除磷,但是其脱氮除磷机理仍未理清。基于此,文中总结了目前发现的反硝化聚磷菌和同时硝化反硝化聚磷微生物的种类及特点,并对其脱氮与除磷的关系及其机理进行了系统性分析,对目前反硝化除磷存在的问题进行了梳理,最后对今后的研究方向进行了展望,以期为完善反硝化聚磷菌的脱氮除磷机理及工艺改进提供参考。     

反硝化聚磷菌的脱氮除磷机制及其在废水处理中的应用

摘要:水体富营养化是当前水污染治理的重点关注对象,利用微生物脱氮除磷开展富营养化水体治理是一种重要的技术。基于反硝化细菌和聚磷菌的脱氮除磷功能,兼具反硝化和聚磷功能的微生物研究及其在污水工艺中的应用越来越广泛。在厌氧和好氧/缺氧环境中,反硝化聚磷菌的脱氮除磷机制有很大差别,且在化学和酶学方面都有所体现。其中,质子驱动力/电子受体理论能够很好地解释反硝化聚磷的化学过程,而反硝化酶系和多聚磷酸盐激酶是酶学过程的主要参与者。当前研究已明确在不同氧含量环境中氮素对磷去除的影响机制,但是否存在磷对除氮作用的影响仍有待进一步研究。在此基础上,本文以氮-磷的偶联过程为切入点,分别从反硝化聚磷的化学过程和酶学机制方面进行简要综述。此外,介绍了反硝化聚磷菌在实验室以及工厂化污水处理中的应用近况,并提出了今后的研究重点与方向,以期为反硝化聚磷菌在环境修复中的进一步开发应用提供理论依据。     

反硝化除磷菌筛选及其特性研究

【目的】研究反硝化除磷菌特性。【方法】通过微生物筛选和生物学特性研究方法,从对虾养殖池塘中筛选出多株可在有氧条件下同时具有反硝化除磷功能的菌种。【结果】菌株LY-1可在18 h内将初始量为10 mg/L的亚硝酸盐氮降低至0.04 mg/L,PO43?-P降低至0.05 mg/L。在DO浓度为5.0?5.9 mg/L时,该菌反硝化除磷率近100%。试验选取具有反硝化除磷功能的枯草芽孢杆菌为阳性对照菌,大肠杆菌为阴性对照菌,比较研究了菌株LY-1在不同pH、温度、盐度、PO43?-P浓度、亚硝酸盐浓度时反硝化除磷的强弱,在pH为5?9范围时,该菌亚硝酸盐氮去除率近99%,PO43?-P去除率86%;温度为30°C时,该菌反硝化除磷率近100%;盐度为5‰?15‰、PO43?-P浓度为10 mg/L、亚硝酸盐氮浓度为20 mg/L时,该菌亚硝酸盐氮和PO43?-P去除率均可达99%。【结论】菌株LY-1反硝化除磷性能显著高于对照菌(P<0.05)。通过菌株LY-1形态学观察、生理生化及16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。     

好氧反硝化菌的筛选及其脱氮除磷性质的研究

利用富集培养基, 从用生活污水驯化后的活性污泥中筛选得到一株具有好氧反硝化兼具除磷功能的细菌。通过形态学及生理生化指标鉴定其为假单胞菌属。利用此好氧反硝化菌处理模拟废水及生活废水, 通过监测总氮、无机磷及CODcr变化确定在C/N摩尔比为3:1、接种量为10%、pH 6.8、30°C条件下处理2 d, 该菌株脱氮、除磷及去除有机物的效果最佳, 活性污泥经此好氧反硝化菌强化后, 对生活废水的处理能力得到明显提升。     

脱氮除磷假单胞菌的筛选及定量检测

【目的】筛选具有较强脱氮除磷能力的细菌,建立结合S1酶保护分析的分子探针技术,以分析该菌在发酵过程中的数量变化情况。【方法】采用缺磷培养基厌氧培养、富磷培养基好氧培养和硝酸盐还原产气实验进行脱氮除磷菌筛选。通过16S rRNA基因序列分析及同源性比对,结合菌株的生理生化鉴定试验,鉴定筛选株。设计相应的16S rRNA探针组,建立结合S1酶保护分析的分子探针技术。【结果】筛选的菌株被鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.,命名为LY10。菌株LY10在富磷培养基中好氧培养24 h,总磷去除率达90.01%。在反硝化聚磷培养基中培养48 h,总氮和总磷去除率分别为84.71%和89.37%。针对假单胞菌16S rRNA基因序列设计了一组用于结合S1酶保护分析的分子探针Probe-P.sp,该探针具有很高的甄别灵敏度,能够将LY10与丛毛单胞属(Commonas)等5种细菌区分开;分子探针定量分析假单胞菌LY10,其细胞量与吸光值呈线性关系,检测的线性范围为103~106 cells/mL,线性方程为:y=-0.967 87+0.372 99x(R2=0.996 7,n=5)。【结论】新筛的假单胞菌LY10的脱氮除磷能力较强,具有生物脱氮除磷的工业化应用潜质。所建立的结合S1酶保护分析的分子探针技术的特异性和灵敏度良好,有望应用于混菌体系中的假单胞菌的定性定量分析。     

传统厌氧/好氧生物除磷与厌氧/缺氧反硝化除磷效能的比较

采用序批式反应器(SBR),对比厌氧/好氧(A/O)和厌氧/缺氧(A/A)2种运行模式对模拟生活和工业混合污水同时脱氮除磷的效能。结果表明:反硝化聚磷菌完全可以在厌氧/缺氧交替运行条件下得到富集,稳定运行的2种模式对有机物和P的去除率分别保持在90%和85%以上,且A/A SBR具有更强的释磷能力,其释磷量比A/O SBR高出1.2倍。进一步试验表明:磷的释放在有无硝酸盐的情况下效果是不同的。2个系统内污泥均有反硝化除磷能力,A/A SBR中所含反硝化聚磷菌(DPAO)的比例是A/O SBR的4.56倍。2种模式出水水质都能取得较好的效果,且能实现同步除磷脱氮,而反硝化除磷在生物除磷方面更具优势。     

好氧甲烷氧化耦合反硝化极限脱氮系统的效能及应用

【目的】探究甲烷浓度、温度和氮浓度对好氧甲烷氧化耦合反硝化(AME-D)极限脱氮系统的影响,分析该系统微生物群落结构,并对贵阳某污水处理厂尾水进行应用研究。【方法】采用阶段性实验研究甲烷浓度、温度和氮浓度对系统脱氮效能的影响,通过16SrRNA基因测序技术分析系统中微生物群落结构,利用共焦显微拉曼光谱仪分析实际废水水质变化特征。【结果】甲烷进气比为3%、温度为30°C、氮浓度为20 mg/L时脱氮效果最好,系统的总氮、氨氮和硝酸盐氮平均去除率分别为93.66%、96.13%和92.25%;系统中的主要甲烷氧化菌分别为Methylosarcina(1.84%)、Methylovulum(0.01%)和Crenothrix(0.14%),以及兼性甲烷氧化菌属Methylocystis(1.9%),主要的亚硝化菌为Nitrosomonas(0.008%),硝化菌为Nitrospira (0.42%),反硝化菌为Hyphomicrobium (1.19%)和Pseudomonas (0.61%);采用该系统处理贵阳某污水处理厂尾水时,出水总氮平均浓度达到0.96mg/L,能达到极限脱氮的目的,拉曼光谱分析显示系统对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有较高的去除,甲烷被氧化形成的中间产物可能为醇类或醛类物质,为反硝化菌提供所需碳源。【结论】AME-D极限脱氮由多种微生物协同实现,其功能微生物为甲烷氧化菌、亚硝化菌、硝化菌和反硝化菌,应用研究显示该系统在城镇污水处理系统中具有较大的应用潜力。     

菌藻共生系统对序批式反应器处理养猪废水脱氮除磷效果及微生物群落结构的影响

【背景】养猪废水作为高浓度有机废水,是导致我国农业面源污染的主要因素之一。目前采用菌藻共生系统处理养猪废水越来越受到关注,与传统序批式反应器(Sequencing Batch Reactor,SBR)相比,藻辅助SBR具有提高脱氮除磷效果、增加污泥活性和降低能源消耗的特点。【目的】针对SBR中菌藻共生系统对养猪废水脱氮除磷效能的影响,比较分析菌藻共生系统与常规SBR系统中污泥特性及微生物群落结构特征差异。【方法】在室温条件下分别平行运行SBR+微藻(R1)和作为对照系统不添加微藻的SBR(R2)。监测R1和R2系统废水处理效果,污泥的粒径、沉降性和代谢产物等污泥特性。利用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技术分析R1和R2系统中的微生物种类和分布。【结果】与对照R2反应器相比,R1的化学需氧量(Chemical Oxygen Demand,COD)去除率提高了5.1%,NH4+-N提高了20.3%,总氮(Total Nitrogen,TN)提高了19.4%,总磷(Total Phosphorus,TP)提高了23.9%。进一步对反应器中的污泥特性进行分析发现,与R2相比,R1的胞外聚合物(ExtracellularPolymericSubstances,EPS)平均含量提高3.7%,可溶性微生物产物(Soluble MicrobialProduct,SMP)平均增加了38.5%。同时R1的污泥粒径较R2提高了14.8%,污泥体积指数(Sludge Volume Index,SVI)值较R2降低了11.7%,污泥的好氧呼吸速率(Specific Oxygen Uptake Rate,SOUR)较R2提高了64.8%,而且稳定的菌藻共生系统的形成进一步减少反应器出水中的悬浮固体浓度,表明藻类的添加对R1污泥特性具有改良作用【结论】R1反应器形成的菌藻共生体系可进一步优化微生物群落结构,其中放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)为R1反应器的主要菌群,对养猪废水的处理起到重要作用。R1反应器中的藻类主要为链带藻属(Desmodesmus)和尖带藻属(Acutodesmus),对养猪废水的脱氮除磷起到重要作用。     

Isolation and Characterization of Pseudoxanthomonas sp. Strain YP1 Capable of Denitrifying Phosphorus Removal (DPR)

A bacterial strain (designated as YP1) was isolated from an aerobic granular sequence batch reactor (SBR) performing simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Based on the morphological, biochemical characteristics, and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequence, YP1 was identified as Pseudoxanthomonas sp. strain. Strain YP1 was confirmed to have the ability to conduct denitrifying phosphorus removal (DPR). The optimal conditions for YP1 were pH 8.0, phosphorus (PO₄^3?-P) concentration of 8.0 mg/L, sodium citrate as carbon source, and nitrate nitrogen (NO₃^?-N) concentration of 30 mg/L. The functional genes including ppk and ppx, narG and narA, nirS and nirK were amplified for understanding the DPR pathways. The results provide more information about denitrifying polyphosphate-accumulating organisms (DPAOs) in aerobic granular sludge (AGS) and lay the foundations for full-scale DPR.     

过表达亚硝酸盐还原酶的重组大肠杆菌辅助污水短程硝化

【目的】为了体现并突出亚硝酸盐还原酶在污水脱氮以及短程硝化中的重要性,对过表达亚硝酸盐还原酶的大肠杆菌进行了污水脱氮的研究。【方法】通过转化带有亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒,将亚硝酸盐还原酶在大肠杆菌中过表达,通过分析重组大肠杆菌的产物研究了该酶的表达及还原亚硝酸盐的情况,通过将该重组菌与已报道的硝化-反硝化细菌或生活污水进行混合培养,研究重组菌用于辅助氨氮去除的短程硝化能力。【结果】重组大肠杆菌能正确表达亚硝酸盐还原酶,OD600=2.0的菌悬液在2 h内还原约1 mmol/L的亚硝酸盐,并产生几乎等量的一氧化氮;重组大肠杆菌与Acinetobacter sp.YF14菌株等比例混合时,12 h能够提高氨氮脱氮效率约(36.0±7.4)%,且在4 h时,最大亚硝酸盐的积累量减少37%;重组大肠杆菌(OD600=1.0)12 h内能够提高污水厂活性污泥的脱氮效率约(31.0±5.7)%,且未检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累;溶氧水平对于亚硝酸盐还原酶重组菌辅助脱氮具有明显的影响,中等溶氧量[(6.4?0.7)mg/L]时脱氮效果最好。【结论】过表达亚硝酸盐还原酶的大肠杆菌可以提高污水脱氮的短程硝化能力。     

Use of Stable-Isotope Probing, Full-Cycle rRNA Analysis, and Fluorescence In Situ Hybridization-Microautoradiography To Study a Methanol-Fed Denitrifying Microbial Community

A denitrifying microbial consortium was enriched in an anoxically operated, methanol-fed sequencing batch reactor (SBR) fed with a mineral salts medium containing methanol as the sole carbon source and nitrate as the electron acceptor. The SBR was inoculated with sludge from a biological nutrient removal activated sludge plant exhibiting good denitrification. The SBR denitrification rate improved from less than 0.02 mg of NO₃⁻-N mg of mixed-liquor volatile suspended solids (MLVSS)⁻¹ h⁻¹ to a steady-state value of 0.06 mg of NO₃⁻-N mg of MLVSS⁻¹ h⁻¹ over a 7-month operational period. At this time, the enriched microbial community was subjected to stable-isotope probing (SIP) with [¹³C]methanol to biomark the DNA of the denitrifiers. The extracted [¹³C]DNA and [¹²C]DNA from the SIP experiment were separately subjected to full-cycle rRNA analysis. The dominant 16S rRNA gene phylotype (group A clones) in the [¹³C]DNA clone library was closely related to those of the obligate methylotrophs Methylobacillus and Methylophilus in the order Methylophilales of the Betaproteobacteria (96 to 97% sequence identities), while the most abundant clone groups in the [¹²C]DNA clone library mostly belonged to the family Saprospiraceae in the Bacteroidetes phylum. Oligonucleotide probes for use in fluorescence in situ hybridization (FISH) were designed to specifically target the group A clones and Methylophilales (probes DEN67 and MET1216, respectively) and the Saprospiraceae clones (probe SAP553). Application of these probes to the SBR biomass over the enrichment period demonstrated a strong correlation between the level of SBR denitrification and relative abundance of DEN67-targeted bacteria in the SBR community. By contrast, there was no correlation between the denitrification rate and the relative abundances of the well-known denitrifying genera Hyphomicrobium and Paracoccus or the Saprospiraceae clones visualized by FISH in the SBR biomass. FISH combined with microautoradiography independently confirmed that the DEN67-targeted cells were the dominant bacterial group capable of anoxic [¹⁴C]methanol uptake in the enriched biomass. The well-known denitrification lag period in the methanol-fed SBR was shown to coincide with a lag phase in growth of the DEN67-targeted denitrifying population. We conclude that Methylophilales bacteria are the dominant denitrifiers in our SBR system and likely are important denitrifiers in full-scale methanol-fed denitrifying sludges.     

Mn2+对A/O-BAF系统处理效能和细菌群落多样性的影响

【目的】通过考察Mn²⁺对A/O-BAF系统处理效能及微生物群落多样性的影响,研究了15℃下不同浓度Mn²⁺对A/O-BAF系统处理效能的影响,并通过高通量测序考察了细菌群落多样性的变化情况。【方法】在温度15℃、水力负荷0.50 m3/(m2·h)、气水比10:1的条件下,在进水中投加Mn²⁺,考察反应器处理效能的变化情况,并通过高通量测序对BAF生物膜样品进行分析。【结果】2.0 mg/L Mn²⁺作用下A/O-BAF系统的COD、NH4+-N、TN、TP去除率分别提高3.51%、2.21%、6.26%和12.13%;4.0 mg/L Mn²⁺作用下COD、NH4+-N、TN、TP去除率分别提高了4.24%、1.92%、7.75%和10.73%;Mn²⁺作用下A/O-BAF系统内反硝化细菌和亚硝酸菌的数量明显增加,硝酸菌数量有所减少,生物膜量和生物膜活性提高。高通量测序结果可知:2.0 mg/L和4.0 mg/L Mn²⁺作用下,微生物群落多样性大幅增加,样本OTU数量从4430分别提高到5659和5556;BAF柱内变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、黄色单胞菌科(Xanthomonas)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadacea)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、陶厄式菌属(Thauera)、Denitratisoma、Sulfuritalea和热单胞菌属(Thermomonas)的相对丰度增加。部分微生物丰度[例如Denitratisoma、Sulfuritalea、红环菌科(Rhodocyclaceae)和丛毛单胞菌科(Comamonadacea)]的增加幅度随着Mn²⁺浓度的提高有所减少;Mn²⁺作用下硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和硝化螺菌属(Nitrosospira)的相对丰度减少。【结论】一定浓度下Mn²⁺主要是通过促进A/O-BAF系统的亚硝化和反硝化作用和除磷微生物的生长提高A/O-BAF系统污染物去除效果,但对硝化的促进效果并不明显,且硝酸菌更易被Mn²⁺的抑制和毒害作用所影响。     

耐高浓度氨氮的异养硝化好氧反硝化菌株U1的鉴定及其脱氮特性

【背景】城市垃圾渗滤液是一种成分复杂的有机废水,含氮量高,如果未经处理直接排放到环境中会造成严重的环境污染。【目的】筛选可以耐受垃圾渗滤液中高浓度氨氮并高效去除污水中氮素的异养硝化好氧反硝化菌株,为解决垃圾渗滤液的氮素污染提供功能菌株。【方法】从垃圾渗滤液中筛选分离能耐受高氨氮浓度的菌株,通过测定各菌株的脱氮能力,筛选到一株脱氮能力最强的菌株,命名为U1,通过测定16S rRNA基因序列和生理生化特性确定该菌株为铜绿假单胞菌。进一步研究了菌株U1在不同初始氨氮浓度、碳源、转速、初始pH、碳氮比等单因素变量下的脱氮能力,并结合L₉（3⁴）正交试验研究了菌株U1的最佳脱氮条件。【结果】分离出一株铜绿假单胞菌并命名为U1。该菌株的最优脱氮条件为:初始氨氮浓度为1 000 mg/L,红糖和柠檬酸三钠的混合碳源,pH 6.0,C/N为10,转速为130 r/min,菌株U1的最大总氮去除率为64.37%,最大氨氮去除率为76.73%。对于总氮和氨氮含量分别是2 345 mg/L和1 473.8 mg/L的垃圾渗滤液,菌株U1最大总氮去除率为27.86%...     

香蕉假茎生物炭对根际土壤细菌丰度和群落结构的影响

【目的】将香蕉假茎生物炭施加到土壤,探讨香蕉假茎生物炭对香蕉根际土壤微生物的影响。【方法】以香蕉假茎生物炭(BPB)0、1%、2%、3%的质量比与土壤均匀混合。盆栽培养3个月后分离香蕉根际土壤。采用16S rRNA高通量测序技术对根际土壤细菌群落结构和丰度进行表征。【结果】提高BPB施用量可增加土壤有机质、有效钾、有效磷含量,提高土壤pH值,但降低有效氮浓度。在1%BPB样品中获得2278个OTUs,其显示细菌群落中的最大多样性。施加3%的BPB处理土壤,拟杆菌门、疣微菌门和厚壁菌门的相对丰度显著增加;放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门明显减少。主成分分析发现,1%BPB和2%BPB处理的样本之间土壤细菌群落相似。【结论】施加不同比例BPB改变了根际土壤中细菌丰度和群落结构,且高比例添加改变更加明显。     

铜绿假单胞菌二鸟苷酸环化酶SiaD突变体的功能研究

【目的】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugionsa)二鸟苷酸环化酶SiaD调控着铜绿假单胞菌的生物被膜形成等表型。在研究过表达siaD对生物被膜的调控作用时发现,与野生型siaD基因回补菌株相比,一株回补菌株的生物被膜产量显著升高。本文的目的即是探究该菌株生物被膜产量升高的原因,并对该菌株的其他表型进行研究。【方法】通过测序确定突变位点;利用生物被膜定性和定量实验对发生点突变的菌株表型进行分析;利用Western blotting实验检测SiaD^R119M蛋白表达水平;利用GST-pull down实验检测SiaC蛋白与SiaD^R119M蛋白在体外的结合能力;针对siaD^R119M点突变基因进行融合蛋白表达载体的构建,表达并纯化该蛋白,利用高效液相色谱检测SiaD^R119M的酶活;为了进一步研究c-di-GMP与细菌运动能力的关系,对细菌的运动能力进行检测。【结果】测序比对结果显示,序列的第119个氨基酸发生了突变,由精氨酸突变成了甲硫氨酸。生物被膜定性和定量实验显示,与野生型siaD回补菌株相比,siaD^R119M的回补菌株生物被膜产量增加,siaD^R119A的回补菌株生物被膜产量低于siaD^R119M的回补菌株,siaD^R201A回补菌株生物被膜含量显著增加,siaD^{R119M R201A}双突变回补菌株生物被膜的含量低于siaD^R201A回补菌株。Western blotting和GST-pull down实验证明,与野生型SiaD蛋白相比,SiaD^R119M蛋白表达水平无差别,SiaC和SiaD^R119M蛋白之间存在特异的相互作用。高效液相色谱结果显示SiaD^R119M蛋白酶活降低。运动能力检测实验中,与siaD野生型回补菌株相比,siaD^R119M回补菌株运动能力减弱,siaD^R201A、siaD^{R119M R201A}回补菌株运动能力无差别。【结论】siaD^R119M突变导致生物被膜合成增强,酶活降低,运动能力减弱。我们推测突变后表型的变化可能是因为突变在体内会影响SiaD蛋白与下游效应蛋白的相互作用,加强了下游效应蛋白的信号传导能力,然而具体机制有待进一步探索。     

东北丘陵区林地转型耕地对土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落的影响

【目的】通过研究林地转型耕地对土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落丰度、多样性和结构的影响,为丘陵区耕地长期施肥下农田土壤微生物多样性丧失的影响机制以及未来的退耕还林过程中土壤微生物多样性的提升和土地可持续利用研究提供一些基础数据和技术支撑。【方法】采用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,qPCR)和高通量测序技术解析土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落的丰度、多样性和结构变化,并耦合土壤化学性质分析,明确土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落丰度和多样性与土壤化学性质的关系以及关键的驱动因子。【结果】林地垦殖为农田后,长期施肥导致土壤酸化,pH从5.58降至4.72,而土壤速效磷则从2.49 mg/kg增至49.3 mg/kg。相应地,耕地土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落的丰度和Shannon指数均显著低于林地。基于编码碱性磷酸酶的phoD基因(alkaline phosphatase-encoding gene)序列的物种分类表明,丘陵区土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落的优势门为变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia),其中林地土壤的蓝藻门的相对丰度显著高于耕地。耕地土壤的慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和芽孢杆菌属(Bacillus)的相对丰度显著高于林地,而中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Chlorogloea属、Gemmata属、Phormidesmis属和Pseudolabrys属的相对丰度显著低于林地。土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落结构因林地转型耕地而发生显著改变。phoD基因丰度和Shannon指数与pH显著正相关,而与总磷、速效磷、硝态氮和铵态氮均显著负相关,其中土壤速效磷是这些影响因素中影响最强烈的,长期施用无机磷肥导致含碱性磷酸酶的土壤细菌群落对有机磷分解的能力退化。【结论】林地转型耕地加之长期施肥改变了土壤pH和速效磷,并在其他理化因子的协同驱动下,导致土壤编码碱性磷酸酶基因的细菌群落丰度、多样性和结构的显著变化。