六氯苯对PC-12细胞凋亡的影响

目的：探讨环境内分泌干扰物六氯苯对PC-12细胞凋亡的影响及其可能机制。方法：采用体外细胞培养方法,5%CO2 37℃恒温条件下,将PC-12细胞培养于含10%灭活胎牛血清的高糖DMEM培养基中。0、1、10、20、100、200μmol.L-1六氯苯处理组,每组设3组复孔,培养24 h后应用Cell Counting Kit-8试剂盒进行六氯苯对PC-12细胞增殖和毒性分析;流式细胞术FITC-An-nexinV/PI双染检测细胞凋亡率;Hoechst33258染色及倒置荧光显微镜拍摄细胞平片,观察细胞形态学改变;免疫印记法（Western blot）检测相关蛋白PLCγ及ERK蛋白磷酸化表达变化。结果：随着六氯苯浓度增加,细胞凋亡率升高,呈剂量依赖关系;Hoechst33258染色可见细胞核膨大、染色质边集浓染等凋亡特征;与对照组相比p-PLCγ及p-ERK1/2表达均降低,呈剂量依赖效用。结论：六氯苯能够诱导PC-12细胞凋亡,p-PLCγ及p-ERK1/2信号通路可能在此过程中发挥作用。     

大肠杆菌感染与人巨噬细胞系U937 细胞凋亡的关系及NF-κB的变化

目的探讨大肠杆菌(E.coli)感染与人巨噬细胞系U937细胞凋亡的关系及核转录因子(nuclear factorkappa B,NF-κB)表达的变化。方法以Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测及Hoechst 33258荧光染色观察为指标,研究E.coli感染对人巨噬细胞系U937细胞凋亡的诱导作用;用Western blot方法检测NF-ΚB的表达。结果Ho-echst 33258荧光染色结果表明当细胞与细菌浓度比较低时(1:10)可引起部分细胞凋亡,Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪结果表明,当细胞与细菌浓度比为1:20,1:50及1:100时,细胞凋亡率与对照组相比明显增高,有显著性差异(P<0.001)。NF-κB的表达随着E.coli浓度的增加而逐渐降低。结论E.coli以剂量依赖的方式诱导U937细胞凋亡,在此过程中NF-κB的表达逐渐降低。     

沙蟾毒精诱导肺癌PC-9细胞的凋亡效应及其作用机制初探

本文主要研究沙蟾毒精(Arenobufagin,ArBu)对非小细胞肺癌PC-9细胞的凋亡作用及其作用机制。以非小细胞肺癌PC-9细胞为研究对象,采用MTT法检测ArBu对肺癌PC-9细胞的生长抑制作用,结果发现ArBu各浓度组在不同时间点均对PC-9细胞具有显著的抑制作用。荧光显微镜观察经Hoechst 33258染色的细胞形态,结果显示ArBu给药组细胞减少且出现了染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成,说明ArBu诱导了细胞凋亡。进一步,流式细胞检测仪结果显示细胞凋亡呈明显的量效关系。此外,Western blot结果显示ArBu抑制EGFR/RAF/MEK/ERK信号通路蛋白的磷酸化,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达。上述实验结果表明,ArBu对非小细胞肺癌细胞系PC-9具有明显的生长抑制和促凋亡作用,可作为抗非小细胞肺癌的先导化合物进一步研究。     

三氧化二砷对肝癌细胞系SMMC-7721凋亡及 Smac caspase-9、caspase-3 蛋白表达的影响

目的：研究三氧化二砷（As203）对人肝癌细胞SMMC-7721的促凋亡作用及对Smac、caspase-9、caspase-3表达的影响。方法：人肝癌细胞SMMC-7721经As20,处理,共分为四组,分别为空白对照组、低剂量组、中等剂量组、高剂量组。分别采用MTT、Hoechst33258染色法、Annexin V-FITC／PI双染法观察其对SMMC．7721细胞增殖的抑制,凋亡细胞核的形态学变化,以及诱导凋亡作用;采用Westemblot法检测凋亡相关蛋白Smac、caspase-9、caspase-3表达的变化。结果：MTT显示：As203在体外能明显抑制SMMC-7721的生长,具有时间剂量依赖关系,与空白对照组相比,其余三组细胞生存率明显下降,差异均有统计学意义（P〈0．05）;Hoechst33258显示细胞呈明显的凋亡细胞形态学特征,具有剂量依赖性;AnnexinV-FITC／PI双染法显示：As203作用24小时可诱导SMMC-7721细胞凋亡,且呈剂量依赖性,与空白对照组相比（2．69±0．58）,其余三组（4．01±0．58）、（5．99±1．69）、（9．26±2．34）差异均有统计学意义（P〈0．05）;Westernblot显示：As2O3作用SMMC-7721细胞24小时,Smac、caspase-9、caspase-3表达上升,呈剂量依赖性,与空白对照组相比,其余三组蛋白表达量明显增加,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论：-定量的As203能抑制SMMC-7721细胞增殖,促进其凋亡,其机制可能与调控Smac、caspase-9、caspase-3表达有关。     

蚕蛹复合氨基酸对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用

本实验探讨蚕蛹复合氨基酸对人肝癌细胞株SMMC-7721的抑制作用.实验经MTT法检测药物对人正常肝脏细胞株QSG-7701的毒性后,计算药物安全浓度.将不同浓度的蚕蛹复合氨基酸与人肝癌细胞SMMC-7721共培养,采用MTT法测定OD值,评定蚕蛹蛋白复合氨基酸对肝癌细胞株的增殖抑制作用;经Hoechst33258染色和倒置显微镜进行形态学观察以检测细胞凋亡率;流式细胞法测定细胞周期和Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡.细胞毒性实验表明:蚕蛹蛋白复合氨基酸的最大无毒浓度为10 mg/mL.不同浓度的蚕蛹蛋白复合氨基酸对SMMC-7721细胞均有抑制作用,各组与对照组相比差异有显著性(P＜0.05),并呈剂量和时间依赖性.Hoechst33258染色和流式细胞术结果亦证实,蚕蛹复合氨基酸能显著促进SMMC-7721细胞的凋亡.     

ANKRD49通过上调Bcl-xL的表达抑制UV诱导GC-1细胞的凋亡

目的:利用稳定过表达Ankyrin repeat domain 49(ANKRD49)的GC-1(小鼠精原细胞)细胞模型,探讨ANKRD49过表达对GC-1细胞凋亡的影响。方法:40J/m~2紫外线(UV)刺激GC-1细胞2 min诱导凋亡,分别利用流式细胞术、Hoechst33258染色和免疫印迹技术检测过表达ANKRD49对GC-1细胞线粒体膜电位、核浓缩情况和凋亡相关蛋白多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)、Cleaved-Caspase-3、Bcl-xL和Bax的表达变化,以反映ANKRD49对GC-1细胞凋亡的影响。结果:流式细胞术检测结果表明稳定过表达ANKRD49的GC-1细胞线粒体膜电位下降率和细胞凋亡率均明显低于空载体组和裸细胞组(P0.05)。Hoechst33258染色结果显示ANKRD49稳定过表达组细胞的凋亡百分比明显低于其它组(P0.05)。Western blotting检测结果显示ANKRD49稳定过表达组Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达水平明显低于对照组,而Bcl-xL蛋白表达水平明显高于对照组(P0.05)。结论:ANKRD49过表达可抑制UV诱导的GC-1细胞凋亡,其作用可能是直接或间接通过促进Bcl-xL的表达而实现的。     

肝细胞生长因子抑制糖基化终产物诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡作用

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)抑制糖基化终产物(AGEs)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用及其相关分子机制。方法体外培养ECV-304人脐静脉内皮细胞,采用噻唑蓝(MTT)法测定HGF对AGEs作用后ECV-304细胞生长抑制率的影响;通过Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学改变、流式细胞术测定AnnexinV-FITC/PI双染标记的细胞凋亡率,检测HGF对AGEs诱导ECV-304细胞凋亡的影响;Western印迹法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果HGF能明显降低AGEs对ECV-304细胞生长的抑制作用;AGE诱导培养的ECV-304细胞出现明显的凋亡形态学改变,在一定浓度范围内,ECV-304细胞凋亡率与AGEs的浓度和作用时间呈依赖关系,加入HGF处理后可显著降低不同时间的内皮细胞凋亡率;HGF作用ECV-304细胞后Bcl-2蛋白表达明显升高,而Bax蛋白表达无明显变化。结论AGEs能诱导内皮细胞凋亡,而HGF能部分抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡,其作用机制可能与上调Bcl-2蛋白的表达水平有关。     

大肠杆菌对体外培养的THP-1细胞凋亡的影响

目的探讨大肠杆菌(E.coli)感染与THP-1细胞凋亡的关系.方法以THP-1细胞作为E.coli感染的体外细胞模型,当细胞与细菌浓度比分别为1:5,1:10,1:20,1:50及1:100时,用荧光染色技术、Annexin V/PI双染流式细胞仪检测分析等方法检测细胞凋亡率.结果细胞与细菌浓度比较低时(1:5)即可引起部分THP-1细胞发生凋亡,THP-1细胞凋亡百分率随E.coli感染剂量的增加而增加.Hoechst33258荧光染色及流式细胞仪二种方法所得结果一致.结论 E.coli以剂量依赖方式诱导THP-1细胞凋亡.     

pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响

为研究pcsk9基因沉默后对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响,用不同浓度oxLDL 处理THP-1源性巨噬细胞48 h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot分别检测pcsk9 mRNA、NARC-1蛋白的表达．应用Lipofectamine2000转染3对pcsk9 siRNAs进THP-1源性巨噬细胞中,筛选出最有效的siRNA再转染入THP-1源性巨噬细胞,24 h后加入oxLDL处理 48 h,Hoechst33258染色观察细胞评价细胞凋亡,流式细胞术计数检测细胞凋亡率．结果发现,75 mg/L oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h后,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞．同时RT-PCR、Western blot检测发现,pcsk9 mRNA和NARC-1蛋白质表达量均随oxLDL浓度的增加而增加,75 mg/L oxLDL组增加最明显．不同浓度siRNA转染THP-1源性巨噬细胞后,RT-PCR筛选出3对siRNAs的终浓度为80 nmol/L均可出现明显的沉默效应．选取此浓度在蛋白质水平检测基因抑制情况,筛选出最有效的一对siRNA．将筛选出来的siRNA转染细胞24 h后,再用oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示,转染siRNA组凋亡明显被抑制．结果表明,在本研究的浓度范围内,随着oxLDL浓度增加pcsk9的表达随之增加,同时,THP-1源性巨噬细胞凋亡也明显增加,75 mg/L oxLDL最明显,pcsk9 mRNA和蛋白质的表达也在该浓度最高．提示pcsk9 siRNA能有效抑制pcsk9基因的表达,从而有效抑制由oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡．     

pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响

为研究pcsk9基因沉默后对氧化型低密度脂蛋(oxLDL)诱导THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响,用不同浓度oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot分别检测pcsk9 mRNA、NARC-1蛋白的表达.应用Lipofectamine2000转染3对pcsk9 siRNAs进THP-1源性巨噬细胞中,筛选出最有效的siRNA再转染入THP-1源性巨噬细胞,24 h后加入oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色观察细胞评价细胞凋亡,流式细胞术计数检测细胞凋亡率.结果发现,75 mg/L oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h后,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞.同时RT-PCR、Western blot检测发现,pcsk9 mRNA和NARC-1蛋白质表达量均随oxLDL浓度的增加而增加,75 mg/LoxLDL组增加最明显.不同浓度siRNA转染THP-1源性巨噬细胞后,RT-PCR筛选出3对siRNAs的终浓度为80 nmol/L均可出现明显的沉默效应.选取此浓度在蛋白质水平检测基因抑制情况,筛选出最有效的一对siRNA.将筛选出来的siRNA转染细胞24 h后,再用oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示,转染siRNA组凋亡明显被抑制.结果表明,在本研究的浓度范围内,随着oxLDL浓度增加pcsk9的表达随之增加,同时,THP-1源性巨噬细胞凋亡也明显增加,75 mg/L oxLDL最明显,pcsk9 mRNA和蛋白质的表达也在该浓度最高.提示pcsk9 siRNA能有效抑制pcsk9基因的表达,从而有效抑制由oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.