细菌发光的分子生物学及发光基因的应用

本对发光细菌生物发光的分子生物学、发光基因在转染细胞中的表达、发光基因在分子生物这中的应用以及基因工程发光菌的应用进行了综述。     

细菌荧光酶报告基因载体构建及在Hela细胞中的表达

采用ＰＣＲ点突变技术,构建含有细菌荧光酶融合ｌｕｘＡＢ报告基因的重组哺乳动物载体ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ,脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染和Ｇ４１８抗性筛选稳定转染的Ｈｅｌａ细胞。ＰＣＲ和酶切电泳证明构建的正确性;经稳定转染ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ的Ｈｅｌａ细胞,用发光仪可测得较强的发光强度（最大值为４．１２ｍＶ／４０μｇ细胞总蛋白粗提物）。而亲本及ｐｃＤＮＡ３稳定转染的Ｈｅｌａ细胞则在本底值范围,ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ稳定转染与亲本及ｐｃＤＮＡ３稳定转染的Ｈｅｌａ细胞在细胞形态和培养条件等方面无明显差异。本工作为细菌荧光酶作为报告基因在肿瘤细胞中的表达和应用建立了基础。     

荧光素酶研究进展

荧光素酶（Luciferase）可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为60－64kD的多肽链,在Mg^2 、ATP、O2存在时,催化D－荧光素（D－Luciferin）氧化脱羧,发出光（λ=550-580nm）。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶,它催化长链脂肪醛、FMNH2和O2的氧化反应,发出绿蓝光（λ=490nm）。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶可分别从萤火虫和发光细菌中直接提前,亦可用基因工程的方法进行生产。荧光素酶催化的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测,因此该酶有多方面的途径,如应用于快速检测、报告基因分析、有毒有害物质分析等。     

天山北麓典型水库细菌多样性分析

为了探讨天山北麓中段水库细菌的多样性及其功能,选取蘑菇湖水库（MGW）、奎屯/车排子水库（KCW）、安集海水库（AJW）和八一水库（BYW）为典型水库进行宏基因组学分析。多点采集水库水样,收集水样中的微生物,CTAB法提取总DNA,用细菌16S rDNA通用引物扩增V3-V4区,扩增产物进行高通量测序,使用BLAST、USEARCH、QIIME等软件和在线工具分析水库细菌的多样性,使用PICRUSt软件和KEGG数据库预测细菌功能基因组成。结果表明,水库细菌分属18个门、38个纲和181个属,其中AJW的操作分类单元（Operational taxonomic units,OTUs）数量和多样性指数较高。4个水库菌群组成有一定的共性,在门分类阶元上优势菌为变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）;在纲分类阶元上优势菌为黄杆菌纲（Flavobacteriia）;在属分类阶元上优势菌为黄杆菌属（Flavobacterium）。然而各水库菌群组成也存在较大差异,在变形菌门中,γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）的相对丰度在MGW和BYW较高,α-变形菌纲（Alphaproteobacterial）和β-变形菌纲（Betaproteobacteria）分别于AJW和KCW具有较高丰度;芽孢杆菌纲（Bacilli）在AJW和MGW具有较高丰度;相对丰度较高的菌属还包括AJW的动性杆菌属（Planomicrobium）、KCW的马赛菌属（Massilia）、MGW的不动杆菌属（Acinetobacter）和动性杆菌属以及BYW的假单胞菌属（Pseudomonas）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）;另外,AJW特有多种丰度较高的菌纲和菌属,其中微小杆菌属（Exiguobacterium）和CL500-29_marine_group均有利于水质和菌群多样性的维持。PICRUSt功能预测分析表明,4个水库菌群的多种代谢以及遗传信息处理、信号传递和细胞生长相关功能基因丰度较高,并含有环境异生物降解代谢相关基因,其中苯甲酸、氨基苯甲酸酯、氯烷烃和氯烯烃以及萘降解相关基因的相对丰度较高。以上结果提示,天山北麓中段不同水库菌群组成存在差异,其与水源、周边环境和人类活动等因素相关。水库菌群含有芳香族和有机氯等化合物降解相关基因,其可在污染物的降解和生物修复中发挥作用。     

植物病原棒形细菌的分类研究进展

植物病原棒形细菌从棒杆菌属中独立出来之后,对于其中各菌分类地位的确立一直有较多争议。近年来已分别归入棒形杆菌属（Clavibacter）、短小杆菌属（Curtobacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、红球菌属（Rhodococcus）和拉氏杆菌属（Rathayibacter）5个属中。但此后又有人提出有些属中仍有异质性。这些分类上的变化主要是由于分类手段逐渐由传统的形态学分类方法向分子生物学方法和多相分类法过度。新的方法还在不断的完善之中。此外,植物病原棒形细菌分类系统的完善还有赖于植物病理学和微生物学家等多学科科学家的合作。     

植物病原棒形细菌的分类研究进展*

植物病原棒形细菌从棒杆菌属中独立出来之后,对于其中各菌分类地位的确立一直有较多争议。近年来已分别归入棒形杆菌属（Clavibacter）、短小杆菌属（Curobacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、红球菌属（Rhodococcus）和拉氏杆菌属（Rathayibacter）5个属中。但此后又有人提出有些属中仍有异质性。这些分类上的变化主要是由于分类手段逐渐由传统的形态学分类方法向分子生物学方法和多相分类法过度。新的方     

南海东海岛沉积物分离细菌的鉴定及其抑菌活性

[背景] 海洋微生物在活性物质开发方面具有巨大的应用前景,而目前有关南海东海岛微生物的研究鲜少。[方法] 对从东海岛沉积物中分离纯化的海洋细菌,采用形态学观察、生理生化以及16S rRNA基因序列的系统发育分析方法进行鉴定;以大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为指示菌,测定其抑菌活性;对具有抑菌活性的菌株扩增聚酮合酶（Polyketide synthase I,PKSI）基因,并与已知的PKSI氨基酸序列比对;选择具有PKSI基因的代表菌株,检测菌株及其发酵抑菌物的稳定性。[结果] 分离纯化到25株海洋细菌,分属于不动杆菌属（Acinetobacter）、交替单胞菌属（Alteromonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、假交替单胞菌属（Pseudo-alteromonas）、海洋单胞菌属（Oceanimonas）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、微球菌属（Micrococcus）和海杆菌属（Marinobacter）。12株菌株通过基因筛选检测到PKSI编码基因,其中6株菌株具有抑菌活性和PKSI编码基因,并分属于芽孢杆菌属和交替单胞菌属;PKSI氨基酸序列同源性分析推测菌株DHD-15和DHD-a可能产生新的I型聚酮合酶结构。菌株DHD-15和DHD-L生长温度范围为15-40℃,可耐受10% NaCl高盐以及pH 3和pH 11的酸碱条件,但不耐高温;菌株DHD-15产生的抑菌物质可耐受100℃和pH 11的高温碱性条件,在50℃、pH 9条件下制备和室温保藏条件下抑菌活性较高,其稳定性较好。[结论] 南海东海岛沉积物筛选的细菌种具有抑菌活性,具有产聚酮类活性物质的潜力。     

黑粉虫幼虫肠道细菌的研究

从黑粉虫幼虫肠道环境中分离、纯化、培养,获得5个细菌菌株,对其培养性状、染色反应、菌体形态、生理生化反应等进行了系统研究.鉴定结果表明：上述5个细菌菌株分别属于金杆菌属（Aureobacterium）、李斯特菌属（Listeria）、微杆菌属（Microbacterium）、莫拉菌属（Moraxella）、短小杆菌属（Curtobacterium）,其中金杆菌属、微杆菌属、短小杆菌属菌也发现于黄粉虫幼虫肠道环境中.通过研究,既可为黑粉虫生产所需微生态制剂提供微生态理论依据,又发掘了微生物资源,丰富了微生物资源库.     

细菌荧光酶报告基因载体构建及在Hela细胞中的表达*

采用ＰＣＲ点突变技术,构建含有细菌荧光酶融合ｌｕｘＡＢ报告基因的重组哺乳动物载体ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ,脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染和Ｇ４１８抗性筛选稳定转染的Ｈｅｌａ细胞。ＰＣＲ和酶切电泳证明构建的正确性;经稳定转染ｐｃＤＮＡ_３－ｌｕｘＡＢ的Ｈｅｌａ细胞,用发光仪可测得较强的发光强度（最大值为４．１２ｍＶ／４０μｇ细胞总蛋白粗提物）。而亲本及ｐｃＤＮＡ_３稳定转染的Ｈｅｌａ细胞则在本底值范围,ｐｃＤＮＡ_３<     

药用植物刺山柑不同部位细菌群落结构及其多样性

【目的】研究传统药用植物刺山柑（Capparis spinosa L.）不同部位细菌群落结构、物种组成和多样性特征,为药用植物微生物资源的开发及微生物与宿主互作提供理论依据。【方法】本研究以刺山柑地上部植物组织（果实、茎）和地下部土壤（根际土壤、非根际土壤）为研究材料,采用高通量测序技术分析刺山柑不同部位细菌的16S rRNA基因多样性,比较其细菌群落结构和物种组成特征。【结果】刺山柑4种样本共获得的3 649个操作分类单元（operational taxonomic unit,OTU）,属于34门、88纲、248目、464科和1 051属。土壤样本的细菌多样性大于植物组织,细菌群落多样性以根际土壤、非根际土壤、茎和果实的顺序逐渐降低,果实内生细菌群落多样性始终最低,显著低于根际土壤。不同部位相对丰度较高的细菌门如下：植物组织中以变形菌门为主,根际土壤中为变形菌门和放线菌门,非根际土中为厚壁菌门和放线菌门。无色杆菌属（Achromobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、肠球菌属（Enterococcus）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）主要存在于刺山柑植物组织中。游动球菌属（Planomicrobium）、库克菌属（Kocuria）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、微枝形杆菌属（Microvirga）和节杆菌属（Arthrobacter）主要分布于土壤中。β多样性分析结果表明,刺山柑植物组织和土壤的细菌群落结构具有显著差异,同类型样本的细菌群落结构相似。【结论】刺山柑土壤样本中细菌群落的多样性和丰富度均高于植物组织,刺山柑不同部位的细菌群落组成不同。本研究对刺山柑不同部位细菌群落结构进行了初步分析,鉴定了各部位细菌群落中的核心菌群,为以后挖掘刺山柑的功能研究和利用提供了准确的微生物信息。     

六斑异瓢虫成虫肠道细菌分离及鉴定研究

目的通过对肠道菌群的研究,探讨其营养生理,进而改善和研制人工饲料,提高六斑异瓢虫的抗逆力和成活率。方法按照传统的培养分离方法从六斑异瓢虫雌成虫肠道消化道内分离纯化获得5个不同菌株,分别对其培养性状、菌体形态、染色反应、生理生化性状进行了系统研究。结果上述5个细菌菌株分别属于地杆菌属（Terrabacter）、李斯特菌属（Listeria）、短小杆菌属（Curtobacterium）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）和皮杆菌属（Demabacter）。结论六斑异瓢虫的菌群种类与其生活习性有关,为进一步研究适合六斑异瓢虫生长和繁殖的人工饲料提供数据参考。     

不同食料植物对东亚飞蝗肠道细菌状况的影响

目的比较在相同的环境条件下不同食料植物对东亚飞蝗肠道细菌状况的影响。方法以墨西哥玉米、野生马唐为食料植物饲喂东亚飞蝗,在其成虫肠道内和粪沙中分离纯化细菌,获得22株菌株,分别对其培养性状、菌体形态、染色反应和生理生化性状进行系统研究。结果上述22个菌株分别属于稀有杆菌属（Rarobact-er）、短状杆菌属（Brachybacterium）、棒杆菌属（Corynebacterium）、棍状菌属（Clavibacter）、葡萄球菌属（Staphylococ-cus）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、埃希菌属（Eschrichia）、气微杆菌属（Aercmicrobium）、沙雷菌属（Serratia）、克雷伯菌属（Klebsiella）、沙门菌属（Salmonella）、志贺菌属（Shigella）、口腔球菌属（Stomatococcus）、短杆菌属（Brevibacteri-um）、地杆菌属（Terrbacter）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、皮杆菌属（Dermabacter）、短小杆菌属（Curtobacterium）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、微杆菌属（Microbacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和凝结芽胞杆菌属（Bacilluscoag-ulans）。结论不同食料植物对东亚飞蝗肠道细菌种类和数量有很大的影响。     

胶州湾沉积物可培养细菌的多样性及其抑菌活性

【目的】海洋微生物在活性物质开发方面具有巨大的应用前景。为了研究胶州湾微生物的多样性和抑菌活性,选取胶州湾9个观测站点的沉积物进行了细菌多样性及抑菌活性分析。【方法】采用YPD和Z2216E培养基分离细菌,通过16S r RNA基因测序对分离菌株进行分类鉴定,继而采用牛津杯法考察分离菌株对7株指示菌的抑菌活性,最后用PCR方法筛选16株代表菌的PKSI、NRPS、CYP、Phz E和d TGD基因。【结果】从胶州湾沉积物中共分离出76株细菌,通过对16S r RNA序列分析,将其归为8个科11个属:节杆菌属、考克氏菌属、微球菌属、微杆菌属、假交替单胞菌属、Oceanisphaera、海单胞菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、硫胺素芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属,其中分离细菌中有34株至少对1种指示菌有抑菌活性。所选取的16株菌均能检测到一种功能基因,且其中5株菌能同时检测到3种以上的功能基因。【结论】以上研究表明胶州湾海域有丰富的微生物资源,在生物活性次级代谢产物合成上有较大潜力。     

Biolog细菌自动鉴定系统应用初探

利用BiloogMicrostation细菌自动鉴定系统（3.50版）对已知的9个属23株菌进行了鉴定。24hBiolog系统鉴定结果：12林革兰氏阴性菌中，9株可准确鉴定到种的水平（75％），3株未达到属的水平。11株革兰氏阳性菌均属于芽孢杆菌属，全部鉴定到属的水平，9株准确鉴定到种的水平（81.8％）。总计属的水平准确率86.9％（20／23），种的水平准确率78.2％（18／23）。     

北极海洋沉积物中锰细菌的分离与系统发育

对中国第二次北极科学考察采集的北极海洋沉积物中的锰细菌进行了筛选、分离和系统发育分析。根据其在筛选平板上菌落的形态学特征,分别从站位P11和S11采集的沉积物中分离到了21株和19株锰细菌。系统发育分析表明,两个站位的锰细菌群落组成有着明显的差别。站位P11分离的可培养锰细菌主要由细菌域（Bacteria）中变形杆菌门的γ-变形杆菌纲（γ-Proteobacteria）和放线菌纲（Actinobacteria）组成,二者分别占86％和14％;γ-变形杆菌纲主要包括嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、希瓦氏菌属（Shewanella）、假交替单胞菌属（Pseudoaheromonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、海杆菌属（Marinobacter）,其中以嗜冷杆菌属为主,其比例可达67％。从站位S11分离到的可培养锰细菌主要包括细菌域中变形杆菌门的α-变形杆菌纲（α-Proteobacteria）和γ-变形杆菌纲以及拟杆菌门（Bacteroides）中的黄杆菌纲（Flavobaeteria）;γ-变形杆菌纲主要包括希瓦氏菌属、海单胞菌属（Marinomonas）和交替单胞菌属（Aheromonas）,α-变形杆菌纲主要为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）。实验菌株均对Mn^2＋有着较强的抗性,其中以菌株Marinomonas sp．S11-S-4耐受性最高。     

蕙兰根内可培养细菌的物种多样性

以MS基本培养基添加蕙兰菌根浸出液制成的培养基进行分离培养的方法,从野生蕙兰（Cymbidium faberi）根部首次分离到内生细菌。经过分离纯化培养获得纯菌株27株。经过16S rDNA基因序列测序,并与GenBank数据比对,其相似性均在98%以上,分析鉴定结果表明,存活的22株菌可分为8属14种。分别隶属于伯克氏菌属（Burkholderia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽胞杆菌属（Bacillus）、Leifsonia属、贪食菌属（Variovorax）、欧文氏菌属（Erwinia）、Duganella属和不动杆菌属（Acinetobacter）。对这些菌株进行分离培养及鉴定有助于理解兰花与微生物之间的相互作用关系,为开发利用这些微生物开辟新的思路。     

小龙虾肠道细菌群落多样性及产蛋白酶细菌的筛选

【背景】养殖动物对饲料的消化利用往往与肠道菌群密切相关。【目的】揭示小龙虾肠道细菌群落组成,并从小龙虾肠道筛选产蛋白酶细菌。【方法】在Illumina MiSeq PE300平台对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行高通量测序,分析小龙虾肠道细菌群落多样性;通过酪蛋白平板法筛选产蛋白酶细菌并进行分子生物学鉴定。【结果】小龙虾肠道细菌优势门包括变形菌门、软壁菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等4个门,累计占比为98.53%;优势属包括柠檬酸杆菌属、支原体科Candidatus_Bacilloplasma暂定属、哈夫尼菌属、肠球菌属、拟杆菌属、梭菌科未分类属、希瓦氏菌属等7个属,累计占比为91.67%。通过酪蛋白平板法筛选的产蛋白酶细菌来自哈夫尼菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和芽孢杆菌属。【结论】小龙虾肠道细菌核心类群在蛋白质消化利用中发挥了重要作用。     

氧化塘中细菌种群组成动态

对武汉地区氧化塘中的细菌数量、细菌种类、种群组成、优势种及群落多样性进行了初步研究。从氧化塘中分离的细菌经鉴定属于12个属,主要有假单胞菌属(Pseudomonas)、棒杆菌属(corynebacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)和微杆菌属(Microbacterium),其它菌属是芽孢杆菌属(Bacillus)、色杆菌属(Chromobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)和链球菌属(Streptococcus)。在5个小塘中,细菌数量、种群组成和群落多样性指数都有不同,这与各塘的污染程度有关。由此,多样性指数可用于监测氧化塘的净化效果。     

河南卢氏和江西宜春两处锂矿山地表微生物群落分布特征差异及成因分析

[目的] 揭示地表锂矿石表面和风化产物中细菌群落多样性特征。[方法] 针对细菌16S rRNA片段扩增进行高通量测序,分析不同锂矿石表面及其风化产物中细菌群落组成、多样性及功能属性等信息。[结果] 河南卢氏南阳山伟晶岩型锂矿石和江西宜春花岗岩型锂矿石表面及其风化产物的细菌群落多样性有差异。南阳山伟晶岩矿石与其风化产物、宜春花岗岩矿石表面和风化产物（NK-1、NK-1F、YK-1、YK-1F、YK-2、YK-2F、YK-3）的OTUs分别是1010、540、835、828、1117、974和604,其差异与不同的矿物组成显著关联。两矿山均有其优势微生物,在门水平上,两矿山均以放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门。同时两矿区微生物群落组成具有显著差异性（P<0.05）,不同地理位置风化产物样本之间差异尤为显著（P<0.001）;在属水平上,NK-1中相对丰度大于5%的属为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、马赛菌属（Massilia）;NK-1F为类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、杆状细菌属（Bacillus）、马赛菌属（Massilia）;YK-1F为芽球菌属（Blastococcus）、念珠菌固体杆菌属（Candidatus-Solibacter）、Noviherbaspirillum属、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）,YK-2为unidentified-Chloroplast属,YK-2F为北里孢菌属（Kitasatospora）,YK-3为1174-901-12属、甲基杆菌属（Methylobacterium）。不同地理位置的矿石及其风化物样本的功能注释均涉及代谢、遗传信息处理、环境信息处理等6个代谢通路。[结论] 16S rRNA高通量测序揭示不同地区锂矿石及其风化产物的细菌多样性存在差异,各具优势类群,样本间菌落组成、多样性及功能属性的差异与锂矿石化学组成、风化程度和地理分布密切相关。这项研究揭示了优势微生物类群的元素地球化学功能与含锂矿物地表风化的潜在联系,可为微生物生态分布研究及相关微生物资源开发提供新数据。     

蕙兰根部内生细菌多样性及季节动态变化

为了研究蕙兰（Cymbidium faberi）根部内生细菌群落结构在不同季节里的变化,于不同季节从蕙兰根部分离出内生细菌207株,采用核糖体DNA扩增片段限制性分析（ARDRA）研究了蕙兰根部内生细菌群落组成的季节动态变化。将内生细菌纯培养物扩增近全长的16SrDNA,并用ARDRA对所分离的菌株进行分型,根据酶切图谱的差异,将其分成25个ARDRA型,并选取代表性菌株进行16SrDNA序列测定。结果表明,分离出来的内生细菌分为9个属,包括芽孢杆菌属（Bacillus）、伯克氏属（Burkholderia）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、假单胞属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、Lysinibacillus、Cohnella和短杆菌属（Bre—vibacterium）,其中优势种群为Bacillus,次优势种群为Paenibacillus和Burkholderia。秋季分离出的内生细菌种类最多,夏季分离出的种类最少。在不同季节蕙兰内生细菌群落结构差异极显著（P〈O．001）,但在不同季节里蕙兰根部内生细菌优势种群没有差异。