基于AFM的活体状态外泌体纳米结构及机械特性研究

外泌体在细胞生理病理活动过程中起着重要的调控作用,研究外泌体的行为特性对于揭示生命活动及疾病发生发展的内在机理具有重要的基础意义.然而由于缺乏合适的观测手段及方法,目前对于活体状态下外泌体结构及特性的认知仍然很不足.原子力显微镜(AFM)的发明为研究溶液环境下天然状态生物样本提供了强大的技术工具,已成为生物学重要研究手段.本文利用AFM对单个活体状态外泌体的纳米结构及机械特性进行了研究.通过多聚赖氨酸静电吸附作用将从淋巴瘤患者骨髓中分离的外泌体吸附至基底,在溶液环境下实现了对单个活体状态外泌体的高质量AFM形貌成像并通过与空气中成像结果进行对比揭示了空气干燥处理对外泌体形貌的影响.在此基础上,分别利用AFM压痕试验和多参数成像技术实现了对单个活体状态外泌体机械特性的定量测量和可视化表征.最后基于所建立的方法技术揭示了化学处理后外泌体结构和机械特性的动态变化.研究结果为研究纳米尺度下活体状态外泌体的结构及特性,以更好理解天然状态外泌体的生理行为提供了新的方法和思路,对于外泌体研究具有潜在积极的意义.     

基于多参数成像AFM的细胞及分子力学特性探测研究进展

原子力显微镜(AFM)的发明为微纳尺度下高分辨率探测天然状态生物样本的物理特性提供了强大工具,是对传统生化特性检测方法的有力补充.近年来,多参数成像模式AFM的出现使得人们不仅可以获取生物样本表面形貌特征,还能同时获取生物样本多种力学特性图(如杨氏模量、黏附力、形变等),为研究生物结构、力学特性及其生理功能之间的关联提供了新的技术手段.多参数成像AFM的生物医学应用研究为细胞/分子生理活动及相关疾病内在机理带来了大量新的认识.本文结合作者在AFM细胞探测方面的研究工作,介绍了多参数成像AFM工作原理,总结了多参数成像AFM在细胞及分子力学特性探测方面的研究进展,并对其存在的问题进行了讨论和展望.     

单个腺病毒颗粒的原子力显微镜液相成像及样品制备方法

原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)作为一种纳米级高分辨率的探针扫描显微镜,在病毒形态学研究等领域有广泛的应用。为更好地利用AFM在接近病毒生理环境(液相)中观测单个病毒颗粒,选择合适的基底吸附病毒样品是重要的前提保障。本文介绍了一种病毒样品制备及AFM液相成像方法。首先制备疏水化处理的玻璃盖玻片作为吸附基底,再将观察样品腺病毒重组载体颗粒(Adenovirus type 5F35,Ad5F35)吸附于基底上,建立在液相下单个病毒颗粒的原子力显微镜成像方法。通过该方法获取了单个腺病毒颗粒在液相下的高分辨率纳米级高度图(height image),且病毒颗粒保持了约90nm的正确测量高度。实验结果表明疏水化处理的玻璃基底具有良好的吸附力,有助于病毒颗粒牢固地吸附在基底上,且不会引起较大的形变。本研究为AFM观测病毒等生物样品提供了一种较为合适的吸附基底和在液相中的AFM成像方法,对后期开展病毒形态结构、物理属性及其与宿主细胞受体相互作用的研究打下基础。     

结合原子力显微镜和光学图像识别的单细胞力学特性快速测量研究

目的 细胞力学特性在生理病理变化过程中起着关键调控作用,开展细胞力学特性研究为揭示生命活动奥秘及疾病发生发展演变规律提供了新的视角。原子力显微镜（AFM）的出现为单细胞力学特性研究提供了强大的技术手段。AFM的独特优势是不需要对活细胞进行任何预处理即可在溶液环境下对天然状态的活细胞力学特性进行高精度（纳米级空间分辨率,皮牛级力感知灵敏度）探测。基于AFM压痕实验的细胞力学特性探测已成为生命科学领域的重要研究方法。然而,现有基于AFM的单细胞力学特性测量主要依赖于人工操作,特别是在测量过程中需要人工控制AFM探针移动到细胞表面特定位置进行压痕实验,导致实验过程耗时费力且效率低下。本文通过将AFM与光学图像自动识别相结合建立了单细胞力学特性快速测量方法。方法 分别利用UNet++深度学习网络模型和模板匹配算法识别出光学图像中的细胞及AFM探针,在此基础上自动确定细胞和AFM探针之间的空间位置关系,并控制AFM探针准确移动至目标细胞表面进行压痕实验。在光学显微镜视觉导引下利用AFM微操作将单个微球黏附至AFM探针悬臂梁制作得到球形针尖探针。选取HEK 293（人胚胎肾细胞）和MCF-7（人乳腺癌细胞）两种细胞进行实验。利用Hertz-Sneddon模型对在细胞表面获取的力曲线进行分析得到细胞杨氏模量。结果 基于光学图像识别结果可将AFM探针针尖准确移动至目标细胞（HEK 293或MCF-7）并对细胞力学特性进行测量,同时实验结果表明本文所提出的方法不仅适用于常规AFM锥形针尖探针,也适用于AFM球形针尖探针。结论 将AFM与光学图像识别结合显著提升了AFM细胞力学特性测量效率,为高通量自动化AFM单细胞力学特性探测提供了新的方法和思路,对于细胞力学特性研究具有广泛的积极意义。     

基于原子力显微镜的溶液流动环境下癌细胞力学特性测量研究

目的 细胞力学特性在细胞生理病理活动过程中起着重要的调控作用，开展细胞力学特性研究对于揭示生命活动内在规律具有重要意义。原子力显微镜（AFM）的发明为单细胞力学特性表征提供了新的强大工具，基于AFM压痕分析的细胞力学特性探测已成为生命科学领域的重要研究方法，为单细胞行为研究带来了大量新认识。然而，现有基于AFM的细胞力学特性研究主要集中在静态溶液环境，而癌细胞在体内转移过程中处于脉管系统的动态液流环境下，因此现有的测量结果无法完全反映溶液流动环境下的癌细胞真实生理行为，特别是目前对于肿瘤转移过程中液流环境与癌细胞之间相互作用的力学机制的认知还十分有限。本文通过将AFM与液流控制技术结合建立了溶液流动环境下的细胞力学特性测量方法。方法 基于两侧开口培养皿并结合注射泵/抽取泵液流控制搭建细胞培养基动态液流系统，并将其分别与AFM及光学倒置显微镜进行集成。选取MCF-7（人乳腺癌细胞）和HGC-27（人未分化胃癌细胞）两种癌细胞进行实验。利用细胞培养基动态液流系统培养细胞并分析溶液流速以及流动时间对细胞生长及力学特性的影响。在光学显微镜导引下控制AFM对培养基静态/流动环境下生长的细胞进行压痕实验以获取力曲线，并利用Hertz-Sneddon模型对力曲线进行分析得到细胞杨氏模量。利用荧光染色试剂分析溶液流动环境对细胞活性及细胞骨架蛋白的影响。结果 首先分析了溶液流动环境对细胞生长的影响，实验结果表明，与静态培养环境相比，培养基动态液流环境可更好地促进细胞生长。随后分别对静态和流动环境下生长的癌细胞力学特性进行了测量，结果表明当癌细胞生长环境由静态变为动态后细胞的杨氏模量显著减小，且溶液流动环境会导致细胞骨架结构的变化，显示了溶液流动环境对癌细胞力学特性的显著影响。结论 将AFM与液流控制技术结合可对溶液流动环境下的单细胞力学特性进行探测，为研究溶液流动环境与癌细胞之间的相互作用提供了新的方法和思路。     

结合微针及AFM的单细胞精准激励与力学特性同步测量

目的 细胞力学特性与细胞生理病理变化过程及机体健康状态密切相关,研究细胞力学特性对于揭示生命活动内在机制具有重要科学意义.原子力显微镜(AFM)的出现为单细胞研究提供了新的技术手段,它不仅可以在溶液环境下对单个活细胞的形貌结构进行高分辨率成像,还能够对细胞力学特性进行定量测量.基于AFM的单细胞力学特性研究在过去数十年...     

深度学习图像识别辅助原子力显微镜单细胞力学特性精准高效探测

目的 原子力显微镜（AFM）的出现为生命科学研究提供了强大工具,特别是AFM压痕实验技术已成为细胞力学特性探测的重要方法,从单细胞尺度为生理病理活动过程带来了大量新的认识,是对传统生化集群平均研究方法的有力补充。然而现有AFM压痕实验技术存在着依赖人工、效率低下等不足,严重制约了其在生命科学领域的实际应用。本文通过将光学显微成像自动目标识别技术与AFM压痕技术结合,建立了单个游离态细胞及聚团生长细胞的力学特性精准高效测量方法。方法 利用YOLO深度学习算法识别出光学图像中细胞的中心部位,并通过嵌入视觉转换器（ViT）模块的双UNet神经网络模型对细胞边缘部位进行精确分割,同时采用模板匹配算法对光学图像中AFM微球探针进行定位,在此基础上自动确定AFM探针上的微球针尖与细胞不同部位之间的空间位置关系,进而对细胞中心部位和边缘部位的力学特性进行快速测量。选取HEK 293（人胚胎肾细胞）和HGC-27（人未分化胃癌细胞）两种细胞进行验证实验,并利用Hertz模型对获取的力曲线进行分析以得到细胞杨氏模量。结果 在深度学习光学图像自动识别导引下可将AFM探针准确移动至细胞不同部位（中心和边缘）进行力学特性测量,同时实验结果表明,本文提出的方法不仅可对单个游离态细胞进行可靠测量,也适用于聚团生长的细胞。结论 深度学习图像识别在辅助AFM单细胞力学特性精准高效探测方面具有巨大潜力,将深度学习图像识别与AFM结合有助于发展面向生物医学应用的高通量单细胞力学特性测量方法。     

基于AFM的细胞表面超微形貌成像与机械特性测量研究进展

原子力显微镜(AFM)以其独特的优势(纳米级空间分辨率、皮牛级力灵敏度、免标记、可在溶液下工作)成为细胞生物学的重要研究手段.AFM不仅可以对活细胞表面超微形貌进行可视化表征,同时还可通过压痕技术对细胞机械特性(如杨氏模量)进行定量测量,为原位探索纳米尺度下单个活细胞动态生理活动及力学行为提供了可行性.过去的数十年中,研究人员利用AFM在细胞超微形貌成像和机械特性测量方面开展了广泛的应用研究,展示了有关细胞生理活动的大量新认识,为生命医药学领域相关问题的解决提供了新的思路;同时AFM自身的性能也在不断得到改进和提升,进一步促进了其在生命科学领域的应用.本文结合作者在应用AFM观测纳米尺度下癌症靶向药物作用效能方面的研究工作,介绍了AFM成像与细胞机械特性测量的原理,总结了近年来AFM用于细胞表面超微形貌成像与机械特性测量所取得的进展,讨论了AFM表征与检测细胞生理特性存在的问题,并对其未来发展方向进行了展望.     

原子力显微镜 (AFM) 在细菌生物被膜研究中的应用

原子力显微镜(AFM)作为一项重要的表面可视化技术,以其独特的优势(纳米级的空间分辨率、皮牛级力灵敏度、免标记、可在溶液环境下工作)被广泛应用于生物被膜的研究。AFM不仅可以在近生理环境下对生物被膜表面超微形貌进行可视化表征,同时还可以通过纳米压痕对生物被膜的机械特性(弹性和粘性)进行定量测量,利用AFM单细胞和单分子力谱技术可以获得生物被膜形成过程中细胞-基底以及细胞-细胞之间的相互作用力,为生物被膜的实时原位系统研究提供了可行性。本文简述了AFM的基本操作原理,综述了近年来AFM用于生物被膜表面超微结构成像、机械特性测量以及相互作用力研究方面的进展,并对AFM在生物被膜研究中面临的问题和未来的发展方向进行了讨论。     

基于AFM的食虫植物天然水凝胶黏液纳米结构原位成像与分析

天然高分子水凝胶以其良好的生物相容性以及生物可降解性在生物医学领域得到了广泛应用,然而由于缺乏合适的观测手段,目前对于纳米尺度下天然状态水凝胶的精细结构及其特性仍然不完全清楚.原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)的出现为生物材料研究提供了新的强大技术手段,但目前利用AFM对天然高分子水凝胶纳米结构进行原位成像的研究还较为缺乏.本文利用AFM对4种不同类型食虫植物(茅膏菜、捕虫堇、瓶子草、捕蝇草)分泌的天然水凝胶黏液的结构进行了高分辨率原位成像与分析.分别将茅膏菜黏液和捕虫堇黏液平铺至云母表面,在空气中进行的AFM成像结果清晰地显示,茅膏菜黏液和捕虫堇黏液中均含有大量纳米纤维结构,且纳米纤维自组装行为具有多样性.分别将瓶子草黏液和捕蝇草黏液平铺至载玻片表面,在去离子水溶液中进行的AFM成像结果揭示了瓶子草黏液和捕蝇草黏液中均含有大量纳米颗粒,对纳米颗粒进行的统计分析显示,捕蝇草黏液中的纳米颗粒尺寸显著大于瓶子草黏液中纳米颗粒的尺寸.研究结果加深了人们对食虫植物分泌的天然水凝胶黏液的认识,为天然生物材料精细纳米结构研究提供了新的方法和视角.