烟粉虱MEAM1隐种磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆与表达分析

【目的】本研究旨在从烟粉虱Bemisia tabaci中东-小亚细亚1隐种(Middle East-Asia Minor 1, MEAM1)中克隆磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, PHGPX)基因,鉴定其在烟粉虱不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的表达情况,明确其在烟粉虱应对外界环境压力中的功能。【方法】利用3′RACE克隆和测定烟粉虱MEAM1隐种内PHGPX基因的cDNA全长序列,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用定量RT-PCR技术对该基因在烟粉虱MEAM1隐种不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的表达量进行分析。【结果】获得了烟粉虱MEAM1隐种两个磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,分别命名为BtB-PHGPX1(GenBank登录号:KY312116)和BtB-PHGPX2(GenBank登录号:KY312117)。序列分析表明,BtB-PHGPX1基因开放阅读框全长732 bp,编码243个氨基酸;BtB-PHGPX2基因开放阅读框全长567 bp,编码188个氨基酸。序列比对结果表明两基因的编码蛋白内均具有谷胱甘肽过氧化物酶保守的半胱氨酸、谷氨酰胺和色氨酸残基位点。BtB-PHGPX1在烟粉虱MEAM1隐种卵内表达量显著高于其在若虫、伪蛹、雌成虫和雄成虫内的表达量,BtB-PHGPX2在烟粉虱MEAM1隐种卵内的表达量显著低于其在若虫、伪蛹和雌成虫内的表达量(P<0.05)。BtB-PHGPX1和BtB-PHGPX2在雌成虫内的表达量均显著高于雄成虫内。吡虫啉处理雌成虫2 h时两基因的表达量均较对照显著提高(P<0.05),处理后5, 10和24 h时其表达量均较对照显著下降(P<0.01)。【结论】本研究克隆了烟粉虱MEAM1隐种两个PHGPX基因的序列全长,明确了其在不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的差异表达,推测PHGPX在烟粉虱抵御环境压力及杀虫剂胁迫时可能发挥着重要的防御作用。     

漆酶-1基因在烟粉虱MEAM1隐种和温室粉虱中的表达模式比较

【目的】漆酶-1(LAC1)在粉虱-植物互作中发挥重要作用,本研究旨在探讨烟粉虱Bemisia tabaci MEAM1隐种和温室粉虱Trialeurodes vaporariorum两种存在竞争关系的粉虱中LAC1基因表达模式是否存在差异。【方法】测定烟粉虱MEAM1隐种和温室粉虱唾液漆酶-1活力;对温室粉虱LAC1基因进行了克隆和测序;通过荧光定量PCR测定和比较了LAC1在两种粉虱不同发育阶段和成虫不同组织中的表达谱以及取食外施水杨酸(0. 5 mmol/L)的番茄植株后两种粉虱不同发育阶段和成虫不同组织中LAC1的表达水平,同时检测了成虫存活率和产卵量。【结果】酶活力测定结果表明两种粉虱的唾液中漆酶-1活力差异不显著。温室粉虱PCR扩增后得到大小639 bp的LAC1基因中间片段。发育表达谱结果表明,LAC1基因在两种粉虱各个发育阶段均有表达,在烟粉虱MEAM1隐种成虫期表达量逐渐升高,而在温室粉虱各发育时期的表达量无显著差异;烟粉虱MEAM1隐种成虫期LAC1的表达量高于温室粉虱。组织表达结果表明,LAC1在两种粉虱成虫的头胸部、中肠和腹部残骸中均有表达,但在中肠中丰度最高。取食外施水杨酸番茄植株的烟粉虱MEAM1隐种,随取食时间的延长成虫存活率下降,与对照(取食喷施清水的植株)相比差异显著。羽化后14 d时,取食外施水杨酸植株的烟粉虱MEAM1隐种存活率仅为对照的一半,而取食外施水杨酸植株的温室粉虱的存活率与对照相比差异不显著。无论是取食外施水杨酸的植株还是取食对照植株,烟粉虱MEAM1隐种体内LAC1表达量和产卵量均高于温室粉虱。【结论】LAC1在两种粉虱体内表达模式存在差异,这可能在两种粉虱的竞争适应中具有一定作用。     

下调烟粉虱MED隐种BtabCSP6表达对番茄黄化曲叶病毒传播的影响

【目的】番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)是对农业生产造成威胁的主要病毒之一,自然条件下通过媒介昆虫烟粉虱Bemisia tabaci传播。已有研究表明烟粉虱雌成虫比雄成虫具有更强的获毒与传毒能力。本研究旨在探明烟粉虱化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)基因BtabCSP6表达对病毒传播的影响,为控制病毒发生寻找新途径。【方法】使用TYLCV侵染性克隆方法获得带毒番茄植株,微虫笼收集不带毒烟粉虱MED隐种成虫固定在感染TYLCV的番茄植株叶片获毒48 h;利用RT-qPCR技术测定分别取食感染和未感染TYLCV番茄植株的烟粉虱MED隐种雌雄成虫体内BtabCSP1-8基因表达量变化;通过饲喂法利用RNAi对烟粉虱MED隐种雌成虫BtabCSP6基因进行干扰48 h后饲喂TYLCV感染的番茄植株,测定烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和传毒率。【结果】RT-qPCR检测结果表明,与未侵染的烟粉虱MED隐种雌成虫相比,侵染TYLCV的雌成虫体内BtabCSP3和BtabCSP6基因的表达量变化最为显著。同样地,在侵染TYLCV的雄成虫体内,BtabCSP4和BtabCSP6表达量的变化最为明显。饲喂dsBtabCSP6 48 h后,烟粉虱MED隐种雌成虫体内BtabCSP6表达量降低;取食感染TYLCV番茄植株不同时间烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和不同数量雌成虫对未感染TYLCV的番茄植株的传毒率与对照相比均显著降低。【结论】下调烟粉虱MED隐种雌成虫体内BtabCSP6基因的表达,可显著降低烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和传毒率,说明BtabCSP6可能影响TYLCV传播。     

内共生菌Rickettsia对烟粉虱生物学特性的影响

【目的】阐明次生共生菌Rickettsia对烟粉虱生物学特性的影响。【方法】Rickettsia阳性(B~+)和阴性(B~–)的烟粉虱在Rickettsia阳性棉花(C~+)和阴性棉花(C~–)上取食15 d,调查不同处理组烟粉虱的单雌产卵量、发育历期、存活率、成虫寿命以及F_1代雌雄比。【结果】(1)Rickettsia与烟粉虱共生可显著缩短烟粉虱的发育历期,B~+C~+及B~+C~–两处理组烟粉虱卵-成虫的世代发育历期均短于B~–C~+及B~–C~–两处理组。(2)Rickettsia可以提高烟粉虱各龄期的存活率,B~+C~+、B~+C~–、B~–C~+、B~–C~–各处理组烟粉虱世代存活率依次呈下降趋势。(3)Rickettsia对烟粉虱种群的雌雄比也有重要的影响,B~–C~+和B~–C~–处理组中烟粉虱种群雌性比显著小于B~+C~+和B~+C~–烟粉虱处理组。(4)Rickettsia可以影响烟粉虱成虫的寿命及繁殖力,Rickettsia阳性烟粉虱处理组成虫寿命及平均单雌产卵量显著高于阴性处理组。【结论】Rickettsia与烟粉虱共生以及Rickettsia在棉花植株中的存留对烟粉虱的发育、存活以及成虫雌性比、寿命和繁殖力都有有利影响,且Rickettsia与烟粉虱共生时对烟粉虱的影响力度要明显强于Rickettsia存留于棉花植株中时对烟粉虱产生的影响。     

烟粉虱MED隐种抑制蛋白基因Btarrestin的克隆及特性分析

【目的】明确烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种抑制蛋白基因Btarrestin是否参与吡虫啉耐药性。【方法】根据已有烟粉虱转录组数据,利用RT-PCR克隆Btarrestin的全长序列,进行生物信息学分析。通过qPCR分析Btarrestin在烟粉虱MED隐种各个龄期(卵,1-2龄、3龄、4龄若虫,雌、雄成虫)以及吡虫啉处理(100 mg/L)后成虫中的表达量变化,明确其时空表达模式。利用RNAi技术沉默Btarrestin,观察沉默前后Btarrestin表达量和烟粉虱MED隐种成虫死亡率变化。【结果】成功克隆烟粉虱MED隐种Btarrestin的cDNA序列(GenBank登录号: MK204377),编码区全长1 227 bp,编码409个氨基酸,预测所编码的蛋白分子量约为45.33 kD,理论等电点(pI)为8.38。保守结构域分析表明,Btarrestin具有Arrestin_N和Arrestin_C两个超家族保守结构域,符合抑制蛋白家族特征。分子系统树分析表明,Btarrestin与褐飞虱Nilaparvata lugens的Arrestin亲缘关系最近。Btarrestin的表达量随烟粉虱MED隐种的生长发育逐渐升高,成虫期表达量最高。100 mg/L吡虫啉处理成虫24 h后Btarrestin的表达量较对照增加了2.39倍。RNAi干扰Btarrestin后进行生物测定,烟粉虱MED隐种成虫的死亡率上升了31.27％。【结论】Btarrestin可能与烟粉虱MED隐种对吡虫啉的耐药性有关。     

烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒上传播番茄褪绿病毒的特性

【目的】分析与比较烟粉虱Bemisia tabaci MEAM1和MED成虫在辣椒Capsicum annuum植株上对番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)的传播差异,解析媒介昆虫-病毒-寄主植物间的互作关系,为田间辣椒上ToCV防治提供参考。【方法】利用烟粉虱MEAM1和MED成虫及ToCV cDNA侵染性克隆,对烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒植株上获取和传播ToCV的能力进行比较,同时比较烟粉虱MEAM1和MED成虫在健康和携带ToCV辣椒植株上的取食偏好。【结果】在感染ToCV的辣椒植株上接虫后96 h内,烟粉虱MEAM1和MED成虫体内病毒积累量逐渐增加,MED成虫获毒速度和病毒积累量均大于MEAM1成虫的,MED成虫获毒量是MEAM1成虫的1.74倍;MED成虫在辣椒植株上的传毒量明显高于MEAM1成虫,传毒量平均相差9倍,且MED成虫传毒率比MEAM1成虫高29%。MEAM1和MED成虫对健康和感染ToCV的辣椒植株的取食偏好相似,都明显倾向于取食被ToCV侵染的辣椒植株。【结论】烟粉虱MED成虫在辣椒植株上获取、传播ToCV的能力均高于烟粉虱MEAM1成虫,这也是ToCV在我国大面积发生的一个重要原因。     

两个入侵烟粉虱隐种MEAM1与MED对番茄黄曲叶病毒水平传播能力的比较

【目的】烟粉虱 Bemisia tabaci 是番茄黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）在自然界的唯一传播媒介,除了可以直接取食获取TYLCV,烟粉虱还可以通过交配获取此植物病毒。虽然前人研究证明了烟粉虱Middle East-Asia Minor 1 （MEAM1）和Mediterranean （MED）隐种都可以通过交配在两性个体之间水平传播TYLCV,但有关MEAM1与MED隐种水平传播TYLCV的能力是否存在差异,不同研究的结果却并不一致。另外,目前尚无关于烟粉虱的水平传播行为是否有助于TYLCV在田间扩散的相关研究。【方法】从浙江、广东、云南和河南4个省份的田间采集MEAM1和MED隐种烟粉虱种群,在室内应用分子标记对各种群所属隐种鉴定后分别建立7个供试种群,然后观察每个种群内带毒成虫与不带毒成虫通过交配在不同性别个体之间水平传播TYLCV的能力,并选用采自广东的MEAM1隐种烟粉虱模拟群体交配实验探究通过交配获毒的烟粉虱个体是否具有传播TYLCV致健康番茄植株发病的能力。【结果】4个省内的MEAM1和MED隐种烟粉虱都可通过交配对TYLCV进行水平传播,但传播频率一般在10%以下。不同省份的MEAM1隐种种群之间在水平传播TYLCV的能力上无显著差异,不同省份的MED隐种种群之间也不存在显著差异。另外,同一省份的MEAM1隐种与MED隐种之间在水平传播TYLCV的能力上也不存在显著差异,而且在两个隐种中,带毒雄虫将病毒水平传播给不带毒雌虫与带毒雌虫将病毒水平传播给不带毒雄虫的频率没有显著差异。研究还表明,采自广东的MEAM1隐种烟粉虱个体通过交配水平获毒后不能致健康番茄植株发病。【结论】综合以上结果,我们推测TYLCV在中国境内两个入侵烟粉虱隐种MEAM1和MED各自种群内个体之间的水平传播概率较低,对该病毒在田间的扩散可能没有作用或作用不大。     

褐飞虱自噬相关基因NlATG13的表达与功能分析

【目的】自噬参与多种细胞生理过程,自噬相关蛋白ATG13是ATG1/13复合物的组成部分, 在启动自噬中发挥着重要作用。本研究旨在分析ATG13在褐飞虱Nilaparvata lugens中发挥的功能,评估其作为害虫防治靶标的潜力。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用RACE克隆褐飞虱NlATG13的cDNA全长序列;应用生物信息学技术分析NlATG13的核苷酸和氨基酸序列特征。利用RT-qPCR检测其在褐飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫和雌雄成虫)和不同组织(5龄若虫头、胸、中肠和脂肪体以及刚羽化雌成虫的卵巢)中的表达模式。通过显微注射dsNlATG13至3龄若虫进行RNAi敲减NlATG13的表达,探究其对褐飞虱生存和中肠细胞自噬的影响;利用RT-qPCR检测RNAi 4 d时3龄若虫中糖原合成与代谢通路相关基因NlGSK3, NlGS和NlGP的表达量。【结果】克隆得到NlATG13的cDNA全长序列(GenBank登录号: MF805752),其开放阅读框长1 203 bp,编码一个含400个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号: AWW05678.1)。系统发育分析表明,在纳入分析的物种中,NlATG13蛋白与半翅目温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的ATG13蛋白进化关系较为接近。发育表达谱结果表明NlATG13在褐飞虱3和5龄若虫中的表达量显著高于在1-2龄若虫、雌成虫和雄成虫中的; 组织表达谱结果表明NlATG13在5龄若虫头部和脂肪体中的相对表达量较高,在胸部的表达量最低。RNAi结果显示,与dsGFP对照组相比dsNlATG13处理组中褐飞虱中肠细胞中存在明显的糖原颗粒积累,NlGS, NlGSK3和NlGP的表达量均无显著变化,组织ATP含量显著降低;褐飞虱的存活率显著降低,处理第10天时褐飞虱存活率下降到41.4%,而dsGFP对照组的存活率保持在85.6%的较高水平。【结论】 RNA干扰NlATG13基因对褐飞虱的生存和中肠细胞自噬具有显著的抑制效果,NlATG13基因具有作为褐飞虱防治靶标的潜力。     

烟粉虱MED隐种钙离子结合蛋白基因的RNAi及其生物学效应

【目的】前期研究发现烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种2个钙离子结合蛋白(BtCaBP1和BtCaBP2)参与烟粉虱对溴氰虫酰胺的应激反应。本研究旨在通过RNAi干扰钙离子结合蛋白基因,系统揭示钙离子结合蛋白对烟粉虱的生物学影响。【方法】通过dsRNA饲喂法分别干扰烟粉虱MED隐种成虫钙离子结合蛋白基因BtCaBP 1和BtCaBP 2后,qPCR检测BtCaBP 1和BtCaBP 2的表达量;观测并比较了RNAi 3 d后处理组(分别饲喂ds BtCaBP 1和ds BtCaBP 2)和对照组(饲喂ds EGFP)间烟粉虱MED隐种亲代成虫(雌雄)寿命、单雌产卵量以及子一代的卵孵化率和成虫前期发育历期等生物学参数。【结果】分别饲喂ds BtCaBP 1和ds BtCaBP 23 d后,处理组烟粉虱MED隐种靶标基因BtCaBP 1和BtCaBP 2的表达量较对照组均显著降低。处理组中干扰BtCaBP 2后的亲代烟粉虱MED隐种成虫寿命(雌:15.46±1.24 d;雄:13.84±0.38 d)较对照组的(雌:13.25±0.58 d;雄:12.67±0.65 d)显著延长;处理组的单雌产卵量(39.53±3.04)比对照组的(76.06±4.76)显著降低;处理组子一代卵孵化率(81.58%±4.42%)比对照组的(87.22%±3.21%)显著降低;子一代成虫前期发育历期处理组(24.42±1.09 d)比对照组的(27.52±1.73 d)显著缩短。而干扰BtCaBP 1基因后,亲代及子一代上述生物学参数没有显著变化。【结论】干扰BtCaBP 1和BtCaBP 2对烟粉虱MED隐种具有不同的生物学效应,该结果为后续进一步研究钙离子结合蛋白的生物学功能提供了参考。     

温室粉虱和烟粉虱3个隐种中热激蛋白基因hsp70和hsp90含量的比较分析

【目的】昆虫适应新环境的能力与其对温度的耐受能力密切相关。热激蛋白HSP70和HSP90具有提高生物体温度耐受性的功能。烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)不同隐种和不同种粉虱对温度的适应能力有差异,这与它们的热激蛋白基因拷贝数的差异可能相关。【方法】利用实时荧光定量PCR方法,检测入侵型烟粉虱MED隐种和MEAM1隐种、本地型烟粉虱AsiaⅡ1隐种以及温室粉虱Trialeurodes vaporariorum (Westwood)基因组DNA中热激蛋白基因hsp70和hsp90的拷贝数。【结果】不同种类的粉虱和烟粉虱不同隐种体内的hsp70和hsp90的含量均有较大差异,其中hsp70和hsp90拷贝数在入侵型烟粉虱MED和MEAM1隐种中含量较其他两种均高,而在土著种AsiaⅡ1隐种中含量最低,在温室粉虱中居中。此外,相同物种雌雄成虫hsp70和hsp90的拷贝数也不同,雌虫hsp70和hsp90拷贝数约为雄虫的2倍。【结论】不同种粉虱及烟粉虱不同隐种的hsp70和hsp90的拷贝数可能与其耐热性差异相关。本研究为解释不同种粉虱、烟粉虱不同隐种及其不同性别的耐热性差异机制提供了进一步的依据。     

烟粉虱内共生菌Rickettsia在植物体内的分布及转移效率初探

【目的】检测Q型烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)体内Rickettsia的感染情况,研究分析Rickettsia共生菌经烟粉虱传入豇豆植物后的分布、转移效率等。【方法】以Q型烟粉虱为实验材料,利用常规PCR及荧光原位杂交技术(FISH),检测了烟粉虱体内Rickettsia的感染率,以及Rickettsia传入豇豆植物体内后的存留情况。【结果】Q型烟粉虱可以通过取食将Rickettsia传至豇豆植株内;接虫数量与Rickettsia传入效率及其在取食部位相邻的下部叶片中检测到的起始时间呈负相关;Rickettsia经烟粉虱取食传入豇豆叶片后,集中分布在叶片的韧皮部筛管中;基于16S r RNA的系统发育分析结果表明,Q型烟粉虱体内的Rickettsia与经取食传入豇豆叶片的Rickettsia高度同源。【结论】Rickettsia可以通过烟粉虱的取食传入植物体内,并且可以在相邻叶片之间转移传播,Rickettsia在由寄主昆虫向植株传播过程中高度保守。     

烟粉虱内共生菌 Rickettsia 在植物体内的分布及转移效率初探

【目的】检测 Q 型烟粉虱 Bemisia tabaci （Gennadius）体内 Rickettsia 的感染情况,研究分析Rickettsia 共生菌经烟粉虱传入豇豆植物后的分布、转移效率等。【方法】以 Q 型烟粉虱为实验材料,利用常规 PCR 及荧光原位杂交技术(FISH),检测了烟粉虱体内 Rickettsia 的感染率,以及 Rickettsia 传入豇豆植物体内后的存留情况。【结果】 Q 型烟粉虱可以通过取食将 Rickettsia 传至豇豆植株内;接虫数量与 Rickettsia传入效率及其在取食部位相邻的下部叶片中检测到的起始时间呈负相关;Rickettsia 经烟粉虱取食传入豇豆叶片后,集中分布在叶片的韧皮部筛管中;基于16S rRNA 的系统发育分析结果表明,Q 型烟粉虱体内的Rickettsia 与经取食传入豇豆叶片的 Rickettsia 高度同源。【结论】 Rickettsia 可以通过烟粉虱的取食传入植物体内,并且可以在相邻叶片之间转移传播,Rickettsia 在由寄主昆虫向植株传播过程中高度保守。     

泛素-蛋白酶体系统对烟粉虱体内番茄黄曲叶病毒的影响

【目的】泛素化修饰广泛参与细胞周期、信号传导、转录调控、免疫应答等多个方面,是细胞内一种非常重要的蛋白水平可逆修饰。但目前关于泛素-蛋白酶体系统是否参与介体昆虫传播病毒还鲜有报道。本研究旨在探索泛素-蛋白酶体系统在烟粉虱Bemisia tabaci传播番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)过程中所起的作用。【方法】通过RT-qPCR分析取食感染TYLCV和不感染TYLCV番茄植物的烟粉虱成虫体内泛素和蛋白酶体亚基基因的表达,采用Western blot检测TYLCV侵染后烟粉虱成虫体内泛素蛋白含量的变化;饲喂抑制剂和注射双链RNA的方法抑制烟粉虱成虫体内蛋白酶体活性后,通过RT-qPCR测定其体内TYLCV含量的变化。【结果】烟粉虱成虫携带TYLCV后,泛素以及26S蛋白酶体亚基4、6B和β基因的表达量没有发生显著变化,体内游离泛素和缀合泛素的含量以及两者的比例也都没有显著改变,表明TYLCV侵染不会影响烟粉虱体内泛素-蛋白酶体的活性。但饲喂抑制剂(Bortezomib或MG132)或沉默Rpn11抑制蛋白酶体活性后,烟粉虱成虫体内的TYLCV含量显著升高。【结论】泛素-蛋白酶体系统对烟粉虱体内的TYLCV起负调控作用,该系统可能通过直接降解病毒或激活免疫反应等方式抑制病毒含量,进而帮助烟粉虱应对TYLCV带来的不利影响。     

烟粉虱及其优势寄生蜂内共生菌的种类及系统发育分析

为了研究入侵我国的2个主要烟粉虱隐种Bemisia tabaci MEAM1和MED及其3种优势寄生蜂(浅黄恩蚜小蜂Encarsia sophia、丽蚜小蜂E.formosa、海氏桨角蚜小蜂Eretmocerus hayati)体内感染内共生菌的种类丰度,并进一步探讨其系统发育关系,本文利用分子生物学手段对昆虫体内细菌的16S rRNA基因序列进行扩增、测序和分析,并采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)和最大似然法(MaximumLikehood,ML)分别构建优势内共生菌的系统发育树。结果表明,烟粉虱2个隐种内共生菌的种类丰度大于其3种优势寄生蜂,3种优势寄生蜂中丽蚜小蜂内共生菌的种类丰度最高;同源性分析发现烟粉虱和寄生蜂所携带的Rickettsia基因同源性达到99%,属于Rickettsia bellii种,进一步的进化树分析也发现所研究物种的Rickettsia和Hamiltonella均可各自聚为同一进化分支。烟粉虱及其优势寄生蜂体内含有种类丰富的内共生菌,其中优势内共生菌Rickettsia和Hamiltonella各自亲缘关系很近,说明内共生菌在烟粉虱和寄生蜂间可能进行水平传播。     

ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株上烟粉虱寄主适应性及寄主植物营养成分含量和防御反应变化

【目的】本研究以番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)为主体,旨在明确ToCV单独侵染及TYLCV&ToCV复合侵染对烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种寄主适应性的影响,并从寄主植物营养成分和防御角度解析不同番茄病毒侵染对烟粉虱MED隐种寄主适应性影响的生理机制。【方法】ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株后,统计分析番茄植株上烟粉虱MED隐种成虫存活率和产卵量以及番茄植株中氨基酸和总糖含量;通过RT-qPCR技术检测番茄植株茉莉酸(JA)信号通路关键基因(FAD7和PI II)以及水杨酸(SA)信号通路关键基因(NPR1和PR1)的表达模式。【结果】相对于取食健康番茄植株的烟粉虱成虫,取食番茄病毒侵染的番茄植株烟粉虱MED隐种成虫的存活率和产卵量均显著降低,其中以TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株为寄主时,烟粉虱MED隐种成虫的存活率和产卵量均达到最低水平。TYLCV&ToCV复合侵染后,番茄植株中总氨基酸含量、14种水解氨基酸含量以及总糖含量低于ToCV单独侵染番茄植株。ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株后,FAD7和PI II的表达量均显著降低,并且2个基因在TYLCV&ToCV复合侵染植株中的表达水平最低;然而,NPR1和PR1的表达水平在ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株中均有上升趋势,TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株中NPR1表达水平和ToCV单独侵染番茄植株中PR1表达水平均显著高于健康番茄植株中的。【结论】ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染均能够明显降低番茄植株上烟粉虱MED隐种的寄主适应性,且TYLCV&ToCV复合侵染更不利于烟粉虱MED隐种生存;相对于健康番茄植株,ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株营养成分与防御系统发生了变化且存在差异。研究结果为揭示烟粉虱与植物病毒互作提供了参考。     

不同寄主植物上烟粉虱次生共生菌感染与性比相关性

【目的】烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)体内次生共生菌感染受寄主植物的影响,一些共生菌会引起害虫的雌性化,明确田间不同寄主植物上害虫种群中共生菌与性比的相关性,可有利于进一步了解烟粉虱田间种群暴发机制。【方法】采集田间不同寄主植物上烟粉虱成虫,观察其性比,并对其中次生共生菌进行分子检测,分析共生菌携带率与性比相关性。【结果】江苏南京地区棉花、番茄、黄瓜和红薯4种寄主植物上烟粉虱次生共生菌Hamiltonella和Rickettsia感染均存在显著差异,其中Hamiltonella为优势共生菌,感染率依次为:棉花>黄瓜>番茄>红薯。寄主植物间Wolbachia和Cardinium的感染率均无显著差异。各寄主植物上烟粉虱雌性比均高于60%,其中黄瓜上高达75.6%,但不同寄主植物间无显著差异。进一步分析表明,Hamiltonella和Rickettsia感染率均与烟粉虱雌性比呈显著的二次多项式相关性。当Hamiltonella和Rickettsia感染率分别低于69%和5%时,随着感染率提高,烟粉虱雌性比上升,当感染率高于上述值时,则随着感染率增加,雌性比下降。【结论】棉花、番茄、黄瓜和红薯4种寄主植物上烟粉虱均表现出雌性化,但不同寄主植物间性比无差异,烟粉虱体内次生共生菌与性比存在相关性。     

烟粉虱传毒相关蛋白基因的克隆及其表达量分析

【目的】烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一种世界性的入侵性害虫,其传播的番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)给我国番茄生产造成巨大经济损失。为了阐明烟粉虱传播双生病毒的机理,本文拟研究明确B和Q烟粉虱体内传毒相关蛋白Gro EL基因及其表达量。【方法】采用特异性引物克隆了B和Q烟粉虱内共生菌编码的传毒相关蛋白Gro EL基因,并进行序列分析;并利用荧光定量PCR技术检测两种生物型及其获取双生病毒前后该基因的相对表达量。【结果】烟粉虱内共生菌Hamiltonella编码的Gro EL基因全长为1 668 bp,编码555个氨基酸;B、Q烟粉虱该基因的核苷酸序列相似性为99.94%,氨基酸同源性为99.82%;带毒烟粉虱中Gro EL基因的表达量显著高于未带毒的对应生物型烟粉虱;无论带毒与否,Q烟粉虱该基因的表达量均显著高于B(P<0.05)。【结论】烟粉虱携带TYLCV后可诱导Gro EL的表达量升高,B和Q烟粉虱中Gro EL基因及其表达量均存在差异,这可能是B和Q烟粉虱传毒效率存在显著差异的原因之一。     

烟粉虱不同发育阶段解毒代谢酶基因的特异性表达

【目的】基于烟粉虱Bemisia tabaci转录组数据,系统分析了烟粉虱解毒代谢酶基因在噻虫嗪抗性品系中的表达模式,探讨了这些基因在烟粉虱不同发育阶段差异表达的生物学意义。【方法】分别收集室内长期饲养的烟粉虱噻虫嗪抗性和敏感品系的卵、4龄若虫和刚羽化1 d的雌成虫,在烟粉虱转录组数据库中挑选8 394条解毒代谢相关基因设计探针,通过探针杂交,得到烟粉虱噻虫嗪抗性品系表达谱芯片,比较了这些基因在抗性烟粉虱3个不同发育阶段的表达情况。并随机挑选了9个基因,在抗感品系间3个不同发育阶段进行了荧光定量PCR验证。【结果】在抗性烟粉虱的卵和4龄若虫发育阶段,共有3 424个差异表达基因,其中489个是编码3类解毒代谢酶(羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和细胞色素P450多功能氧化酶)的基因;有14个基因在4龄若虫发育阶段过量表达,其中10个为P450基因,4个为GST家族基因。在抗性烟粉虱的4龄若虫和雌成虫发育阶段,总共有1 273个差异表达基因,193个为3类解毒代谢酶家族的基因,其中有9个P450家族基因在雌成虫期的表达量超过4龄若虫期的10倍。此外,表达谱芯片分析还筛选到了一些候选抗性基因。qRT-PCR验证显示在这些候选基因中,与敏感品系相比,9个基因在抗性烟粉虱的3个不同发育阶段表达上调,其中GST基因家族的p_06027和P450基因p_06013在抗性品系的卵和4龄若虫中过量表达;p_05885和p_07806和编码CYP6家族蛋白的p_00988在抗性品系的4龄若虫期的表达量上调;p_05916和p_00478在抗性品系卵和4龄若虫期表达量很低,而在成虫期过量表达;而p_00059和p_00428在抗性品系雌成虫发育阶段表达量显著上调,其中编码CYP4C1的p_00059的差异表达倍数在雌成虫期约为15.15倍。【结论】表达谱芯片分析结果提示,CYP6和CYP4C1基因的过量表达可能会是烟粉虱抗性产生的机制之一。解毒代谢酶基因在烟粉虱不同发育阶段的特异性表达,可能与其在抵御杀虫剂胁迫时体内能量的分布及有效利用率有关,也可能是害虫在环境选择压下的一种适应机制。     

番茄褪绿病毒对MED烟粉虱成虫在不同寄主植物上的寄主选择性和取食行为的影响

【目的】由粉虱传播的番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)具有较强的暴发性和流行性,目前该病毒现已蔓延至世界各地,可为害多种作物,对农林经济生产造成严重危害。病毒侵染会影响介体昆虫的寄主选择性和取食行为,从而影响病毒传播。本研究旨在明确ToCV对MED烟粉虱Bemisiatabaci在不同寄主上的寄主选择性及取食行为的影响。【方法】利用Y型嗅觉仪测定携带和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫的寄主选择性,利用刺吸电位(electrical penetration graph, EPG)技术比较携带和未携带ToCV的烟粉虱雌成虫在健康的番茄、辣椒、棉花和豇豆4种寄主植株上的取食行为差异。【结果】未携带ToCV的MED型烟粉虱雌成虫对于4种寄主植物的选择偏好性排序为番茄、辣椒＞棉花＞豇豆;携带ToCV烟粉虱雌成虫对4种寄主植物的选择性偏好性降低,排序为番茄、辣椒、棉花＞豇豆。与未携带ToCV烟粉虱雌成虫相比,携带ToCV烟粉虱雌成虫取食4种植物所产生的刺探次数均显著增加,第1次到达韧皮部的时间有明显延后,取食总时间与韧皮部的取食时间明显减少。【结论】ToCV使烟粉虱对寄主的选择偏好性和取食行为发生显著改变,从而增加了病毒在寄主植物间传播的可能。     

烟粉虱及温室白粉虱为害后对后续粉虱种群的影响

【目的】分析烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)或温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum(Westwood)为害番茄后对后续温室白粉虱和烟粉虱生长、发育、成虫寿命和繁殖等产生的促进或抑制作用,可为明确寄主植物番茄介导的温室白粉虱-烟粉虱的种间互作,开展粉虱的科学防控提供科学依据。【方法】通过在寄主植物番茄叶片上先将B型烟粉虱或温室白粉虱按不同的顺序、时间间隔分开接种,再系统观察后续接上的两种粉虱生长、发育、繁殖等种群参数的变化。【结果】(1)先期接上烟粉虱对后续温室白粉虱的发育、寿命、产卵量有明显的促进作用;这种作用需烟粉虱的持续诱导,若去掉烟粉虱,其对温室白粉虱的促进作用即消失;先期接上温室白粉虱可缩短后续烟粉虱伪蛹期,但温室白粉虱的持续存在不利于烟粉虱的产卵,且明显降低烟粉虱的内禀增长率和净增殖率。(2)先后在番茄上同时接上温室白粉虱可降低后续烟粉虱的单雌产卵量和雌、雄虫的成虫寿命;先后同时接种烟粉虱却显著地增加了温室白粉虱的单雌产卵量;烟粉虱的提前存在降低了后续烟粉虱单雌产卵量。(3)但两种粉虱之间作用存在着一定的时间滞后性。烟粉虱对温室白粉虱的发育、寿命、产卵量产生的促进作用大约在其卵期后的一段时间才能显现出来;温室白粉虱对烟粉虱伪蛹期的缩短作用也需提前诱导;而温室白粉虱对温室白粉虱的促进作用相当滞后,直到成虫期才显现出来。【结论】B型烟粉虱和温室白粉虱之间可通过寄主番茄产生相互影响,前期烟粉虱为害可显著促进后续温室白粉虱卵和若虫的发育,而前期温室白粉虱为害对烟粉虱的发育不利。