HBscFv–IFNγ在毕赤酵母X33中的表达、纯化及鉴定

为了有效治疗乙肝病而研究了将抗乙肝病毒表面抗原单链抗体(single-chain Fv against HBV surface antigen, HBscFv)与临床治疗乙肝常用的γ-干扰素(γ-interferon, IFNγ)连接的融合蛋白(HBscFv-IFNγ)。采用重叠PCR法将基因hbscfv与ifnγ连接成hbscfv-ifnγ, 再构建成多拷贝重组质粒pPICZαA/(hbscfv-ifnγ)1,2,4, 然后转入巴斯德毕赤酵母X33。从中筛选出的工程菌株X4能够分泌表达目的蛋白HBscFv-IFNγ, 并用SDS-PAGE、Western blotting和ELISA方法进行了初步鉴定, 结果表明组成HBscFv-IFNγ的HBscFv和IFNγ仍具有生物学活性。用14F7亲合层析纯化X4的发酵液可获得纯度达95%~98%的HBscFv-IFNγ。它可中和HBV转基因小鼠血清中27.9%的乙肝病毒表面抗原(HBV surface antigen, HbsAg), 这表明HBscFv-IFNγ上的抗体能够与生物体内的HBV有效结合。可见, HBscFv-IFNγ将是一种防治乙肝病而有开发前景的靶向新药。     

工程酵母X4分泌表达HBscFv-IFNγ的发酵工艺优化

为提高工程菌-毕赤酵母X4诱导表达卸BscFv-IFNγ(抗乙肝病毒表面抗原单链抗体-γ干扰素,single-chin Fv against HBV surface antigen-γ-interferon)的量,本实验通过单因素和正交实验来优化发酵工艺,确定了X4表达HBscFv-IFNγ的最优工艺条件:150mL摇瓶培养84h,甲醇添加量2.2%(v/v),接种后的OD600=6.5,装液量20mL.使HBscFv-IFNγ的产量由起始的15mg/L提高到21.14mg/L,提高达40.9%.这为进一步对HBscFv-IFNγ的纯化、药效研究和高密度培养奠定了基础.     

单链抗体抑制乙肝病毒的研究

单链抗体已用于抗乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)的研究,目前已研制出作用于各种靶点,如HBV表面抗原pre-S1、核心蛋白(hepatitis B virus core antigen, HBc)、DNA聚合酶及X 蛋白的多种单链抗体。单链抗体对偶联的分子具有靶向定位作用,因此,对抗原的亲和性大小、对靶细胞内化(Internalization)的强弱及其自身结构的稳定性是影响单链抗体应用的主要因素。     

乙型肝炎疫苗接种与康泰疫苗事件引发的思考

<正>乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(乙肝病毒)引起的严重危害人民健康的传染病,主要通过血液、医源、性生活和母婴等途径传播,是急慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因.成人感染乙肝病毒多数都可以痊愈,但婴幼儿感染则多数成为慢性持续性感染者.1979年全国乙肝流行病调查人群中乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)平均携带率为9.76%,儿童4岁时HBsAg携带率就已达或接近高     

以牛痘病毒为载体的乙型肝炎病毒表面抗原基因的表达

乙型肝炎是一种严重危害人类健康的疾病,对它的防治国内外均十分重视。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致。HBV是部分单链的DNA病毒,其基因组编码了表面抗原蛋白、核心抗原蛋白以及内源DNA聚合酶等蛋白质。乙肝表面抗原蛋白(HBsAg)是病毒的外壳蛋白,在乙肝病人的血液中能形成直径约22nm的表面抗原颗粒。用它作为抗原给动物注射,可使动物产生专一性抗体。     

可治疗某些慢性乙型肝炎患者的干扰素α—2b

在12个医疗中心的综合研究中,用干扰素α-2b(IFN)治疗的乙肝(HBV)患者中约10%有疗效,例如,在患者血清中不再含乙肝表面抗原(HBsAg).每日给患者剂量为5百万单位的IFN,(单独给药或与脱氢可的松结合给药)、1百万单位的IFN或不给药.IFN给药期16周.始药剂量为5百万单位(单独或与脱氢可的松结合给药)的患者中37%有药效,即患者血液中未检测到HBV DNA或HBeAg.脱氢     

中山市2011年健康儿童脊髓灰质炎、麻疹和乙型肝炎抗体水平监测

目的了解中山市1~14岁健康儿童脊髓灰质炎(脊灰)病毒、麻疹病毒和乙型肝炎(乙肝)病毒抗体水平状况,为维持无脊灰、消除麻疹和控制乙肝提供依据。方法采用多阶段整群抽样方法,随机选择220名1~14岁健康儿童抽取静脉血,采用ELISA法检测麻疹病毒抗体Ig G、乙肝病毒表面抗原和抗体;用中和试验检测脊灰(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)型病毒中和抗体。结果脊灰、麻疹和乙肝病毒抗体阳性率分别为91.36%、93.18%和66.36%,脊灰病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型和麻疹病毒抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶215.90、1∶119.05、1∶31.40和1∶1 254.45;乙肝病毒表面抗原阳性率为1.36%。结论中山市1~14岁健康儿童对脊灰病毒具有较高的免疫水平,已形成对脊灰病毒有效的免疫屏障;乙肝得到有效控制;但麻疹未能形成有效的免疫屏障。     

甘肃省1～59岁人群乙型肝炎病毒感染的血清流行病学调查

为了解甘肃省现阶段乙型肝炎病毒感染的现状,分析乙肝病毒感染血清学指标的变化,采用多阶段整群抽样的方法,抽取5个县区1~59岁人群共2200人进行调查。以ELISA方法对血清标本统一检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)、乙肝病毒核心抗体(抗-HBc)。结果显示,甘肃省1~59岁调查人群HBsAg阳性率为3.59%,抗-HBs和抗-HBc阳性率分别为49.45%、16.33%;HBV总感染率为27.50%。比1992年HBV总感染率下降了36.48%,HBsAg阳性率下降了45.94%;1~4岁儿童HBsAg阳性率仅为1.13%,比1992年(5.34%)下降78.84%。甘肃省1~59岁人群乙肝病毒感染率下降,抗-HBs阳性率升高,尤其在1~4岁儿童变化更为明显;甘肃省乙肝感染逐步呈现由中高流行转向低流行区的趋势;乙肝疫苗免疫取得显著效果。     

待孕夫妇乙肝表面抗原及乙肝表面抗体阳性情况分析

目的分析与探讨待孕夫妇乙肝表面抗原及乙肝表面抗体检测结果,并研究其对临床孕前检查的影响及评价。方法随机选取2015-2017年度在我院进行孕前检查的夫妇2 440对(4 880例)为研究对象,按照年度将待孕夫妇分为两组,每组2 440例,两组均加强孕前检查中的乙肝表面抗原(HBsAg)及乙肝表面抗体(HBsAb)的检测。A组为2015年3月-2016年2月在我院进行乙肝表面抗原及乙肝表面抗体检查的待孕夫妇;B组为2016年3月-2017年2月在我院进行乙肝表面抗原及乙肝表面抗体检查的待孕夫妇。比较两组待孕夫妇乙肝表面抗原及乙肝表面抗体检测的阳性结果。结果 B组HBsAg阳性率、HBsAb阳性率明显高于A组(6.43%vs 4.63%;62.99%vs 58.44%),差异有统计学意义(P0.05)。B组、A组男性HBsAg阳性率明显高于同组女性(59.87%vs 40.13%;60.18%vs 39.82%),HBsAb阳性率低于同组女性(46.52%vs 53.48%;47.41%vs 52.59%),差异均有统计学意义(P0.05)。B组、A组高中及以上学历HBsAg阳性率明显低于同组高中以下学历(38.85%vs 61.95%;38.05%vs 61.15%),高中及以上学历HBsAb阳性率高于同组高中以下学历(53.15%vs 46.84%;51.75%vs 48.25%),差异均有统计学意义(P0.05)结论目前夫妇乙肝感染仍处于增高趋势,对于进行孕前检查的待孕夫妇加强乙肝表面抗原及乙肝表面抗体的检测,有助于疾病的早期诊断、干预及治疗,能够减少乙肝传播,可有效降低新生儿乙肝发病率,促进优生优育,提高出生人口整体素质。     

百色市1～6岁儿童乙肝疫苗接种后免疫水平状况分析

掌握百色市乙型肝炎疫苗纳入儿童免疫规划后的免疫效果,客观评价免疫规划工作现状。方法按现况研究原理,全市12个县(区),每个县(区)各抽取150名儿童,每个县在东、西、南、北、中五个方位随机抽取5个行政村,每个行政村抽取6个年龄组(1～6岁儿童),每个年龄组抽取5名常住儿童(当地居住三个月以上),收集血清样本进行乙肝病毒感染相关标志表面抗原及抗体检测。结果全市共调查1～6岁儿童1 809名儿童,乙肝表面抗原携带率为0.66%,低于2006年全国调查的1～4岁人群乙肝表面抗原携带率(0.96%),达到中国《2006—2010年全国乙型病毒性肝炎防治规划》提出的5岁以下儿童乙肝表面抗原携带率<1%的控制目标要求;1～6岁儿童乙肝表面抗体阳性率为77.77%,高于2006年全国调查的1～4岁人群乙肝抗体阳性率(71.24%)。结论百色市自2003年将乙肝疫苗纳入免疫规划管理后,乙肝免疫效果显著,乙肝病毒表面抗原阳性率大幅度下降,婴幼儿体内保护性抗体水平也高于全国水平。加强对孕产妇住院分娩率和婴幼儿乙肝疫苗接种工作,尤其是乙肝疫苗首针及时接种是今后乙肝预防控制的重点。     

黑龙江省乙型肝炎血清流行病学调查分析

为了掌握黑龙江省乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)流行现状和人群免疫水平,评价我省儿童乙肝疫苗预防接种效果,为制订乙肝预防控制策略提供依据。采用横断面调查方法,选择全省7个国家级疾病监测点,在每个监测点随机抽取2个乡级单位,1～59岁作为目标人群共调查3337名人群。黑龙江省1～59岁人群乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性率、乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)阳性率和乙肝病毒核心抗体(抗-HBc)阳性率经标化后为5.65%、55.45%、30.50%,1～3岁人群乙肝表面抗原阳性率明显低于15～59岁人群。1～3岁、4～10岁和11～14岁人群乙肝疫苗全程接种率为99.43%、89.40%和64.81%;首针及时接种率分别为86.64%、75.57%和49.87。城市和农村HbsAg阳性率分别为3.26%和5.04%。医院出生儿童乙肝疫苗首针及时接种率高于在家出生儿童。结果显示接种乙肝疫苗可明显提高抗-HBs阳性率,提高人群对HBV的免疫保护能力,降低HBsAg携带率。     

利用单细胞RT-PCR体外克隆个体化乙型肝炎表面抗体重链

目的建立一种利用单细胞RT-PCR技术克隆乙型肝炎表面抗体重链的方法,为人源化、个体化的乙肝治疗性抗体研制奠定基础。方法利用单细胞分选技术从乙肝疫苗接种志愿者外周血中分选得到单个抗体分泌细胞（antibody-secreting cells,ASC）,用单细胞RT-PCR克隆其IgG重链全长到pEGFP-N1载体,转染COS-7细胞,上清液用乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）通过Western blot进行结合力验证。结果克隆得到1 500 bp左右的重链全长,重链表达产物经验证能与乙肝表面抗原特异结合。结论克隆得到表达产物能与HBsAg特异结合的重链基因,为我们后期制备抗体轻链、连接轻重链和抗体亲和力鉴定奠定基础。     

表面抗原和表面抗体检测双阳性CD重组型乙型肝炎病毒全基因组序列分析

西藏地区藏族人群乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染率较高,而针对感染者血清中HBV表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)和HBV表面抗原抗体(Hepatitis B surface antibody,HBsAb)双阳性的研究一直进展缓慢,尚无明确的研究结论。为探讨西藏地区藏族人群慢性HBV感染者血清中HBsAg和HBsAb双阳性与基因组核苷酸/氨基酸突变的关系,本研究在西藏选取7个地区作为研究区域,进行多阶段抽样,选取样本进行HBV血清五项指标检测,筛选HBsAg和HBsAb均为阳性的患者血清共24份作为双阳性组,以年龄和乙型肝炎e抗原(HBeAg)等感染指标进行匹配,选取96份HBsAg阳性,HBsAb阴性患者血清作为对照组。HBV全基因组序列通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)产物直接测序获得,并进行重组分析和突变分析。852名西藏HBV感染者中,HBsAg/HBsAb双阳性率为2.82%(24/852)。双阳性组在S蛋白N端和主要亲水区(Major hydrophilic region,MHR)的突变率以及PreS缺失发生率均显著高于对照组。T1753C、C1990T和C2002T等核苷酸突变;S蛋白中V224A、PreS区D103E等氨基酸突变在两组内分布存在显著差异。HBV/CD重组型的HBsAg/HBsAb双阳性发生率与中国乙肝主要流行区域接近。HBV感染者血清HBsAg和HBsAb共存可能与S蛋白,特别是MHR内的高氨基酸突变造成的免疫逃逸有关。PreS缺失、S抗原蛋白C端V224A突变和PreS区D103E突变可能对HBsAg/HBsAb双阳性的产生具有协同作用。     

一种新的乙型肝炎病毒表面抗原结合蛋白的筛选、表达及其生物学活性的初步研究

为了研究乙肝病毒侵染肝细胞过程中的功能蛋白 ,通过印迹免疫分析技术从人肝cDNA噬菌体表达库中筛选出一株编码乙肝表面抗原结合蛋白 (hepatitisBsurfaceantigenbindingprotein ,HBsAg BP)的cDNA克隆 .基因测序结果表明 ,该cDNA具有独立的开放阅读框架 ,编码 1个由 344个氨基酸残基构成的可溶性蛋白分子 ,属于免疫球蛋白超家族成员 .将该基因克隆到原核表达载体pTriplEx后 ,在E .coliXL1 Blue菌株中获得 4 4kD的重组蛋白 .重组蛋白经Western印迹和ELISA实验证明具有与乙肝表面抗原特异性结合的能力 .进一步经流式细胞仪实验显示 ,在纯化的重组蛋白存在的情况下 ,天然的HBsAg与肝细胞株HepG2的亲和力显著增高 .结果显示 ,该乙肝表面抗原结合蛋白可能是介导乙肝病毒对肝细胞亲和侵染的可溶性辅助受体 .     

乙肝治疗性疫苗的研制与临床应用

尽管乙肝预防性疫苗非常有效,我国仍有约9300万乙肝病毒(HBV)携带者。抗病毒治疗疗效有限,患者长期使用容易产生耐药性。因此,研制乙肝治疗性疫苗可补充甚至替代目前的抗病毒治疗。T细胞免疫对于乙肝病毒的控制和清除至关重要,目前已经设计出蛋白疫苗、表位多肽疫苗以及DNA或病毒载体疫苗通过临床试验检验其疗效。将就研制乙肝治疗性疫苗这一日益活跃的领域加以概述,着重评价疫苗的细胞免疫应答和临床疗效。     

肝癌患者体内乙型肝炎病毒基因组的突变

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科,其基因组有3．2kb,含4个重叠的开放阅读框架(ORF),编码核心蛋白、e蛋白、X蛋白、聚合酶以及HBV表面抗原(HBsAg)。为研究HBV的基因突变与肝细胞癌(HCC)发生的关系,本文对来自HCC病人不同基因型的HBV进行测序,研究其X、前C、前S和S区突变情况。     

HBV pre-c-Fc融合蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其生物学活性研究

目的:在杆状病毒表达系统中表达融合蛋白乙型肝炎病毒前C蛋白-小鼠IgG Fc蛋白(HBV precore protein-mouse IgG Fc,HBV pre-c-Fc),并鉴定其免疫原性。方法:目的基因HBV prec-Fc连接到pFastBac1载体,获得的pFastBac1-HBV pre-c-Fc质粒转化DH10Bac感受态,通过Tn7转座子将目的基因转座到Bacmid中,得到Bacmid-HBV pre-c-Fc穿梭载体,脂质体包被后转染Sf9昆虫细胞获得P1代病毒,重复转染Sf9获得高滴度病毒。收集细胞上清超滤后通过Protein G亲和层析柱纯化得到目的蛋白HBV pre-c-Fc。纯化的蛋白大腿内侧肌肉注射免疫BALB/c小鼠并检测血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体产生量。结果:HBV pre-c-Fc在昆虫细胞中成功表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,蛋白产量约为3.03mg/L,纯化蛋白能有效刺激BALB/c小鼠产生特异抗体。结论:成功地在杆状病毒表达系统中表达了具有免疫原性的HBV pre-c-Fc蛋白,为生产乙肝治疗性疫苗奠定了基础。     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

单链抗体(single chain Fv,ScFv)是由抗体重链可变区V_H和轻链可变区V_L通过一段连接肽连接而成的重组蛋白。由于其分子量小,穿透力强,免疫原性低,利于基因工程操作等优点,而具有良好的应用前景。ScFv可在大肠杆菌以包含体形式高效表达,其纯化和复性是大量制备ScFv的重要环节,我们对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)ScFv的纯化     

乙型肝炎人免疫球蛋白预防肝移植术后HBV再感染研究进展

乙型肝炎人免疫球蛋白(HBIG)是含有高效价乙型肝炎表面抗体(HBs Ab)的多克隆球蛋白制剂,其含量占蛋白质总量的96%以上。静脉输注后即刻达到高峰,能与乙肝病毒颗粒外壳上的乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)特异性结合发生抗原抗体反应,从而使病毒失去对细胞的侵袭能力,它与拉米夫定联合应用是公认的预防肝移植术后HBV再感染的有效的常规治疗方法。但是,一旦停止HBIG用药,由于拉米夫定存在耐药性问题,HBV再感染率会升高。为此,国内外在HBIG预防肝移植术后HBV再感染长期效果方面做了大量研究工作,并取得了一些进展,现作一简要综述。     

用Far-Western印迹技术筛选人肝组织中与乙肝病毒表面抗原PreS1相互作用的蛋白

目的:利用Far-Western印迹技术从正常人肝组织中筛选乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原PreS1结合蛋白,为阐明HBV的感染致病机理提供依据。方法:提取正常人肝组织细胞膜蛋白,双向电泳展示后转膜,对表达纯化获得的PreS1的重要片段与GST的融合蛋白PreS/1-48myr-GST进行Far-Western印迹实验,对筛选获得的蛋白点切胶,质谱鉴定。结果:对PreS/1-48myr-GST融合蛋白进行Far-Western-2D筛选,共获得22个蛋白点,经质谱鉴定获得15个候选相互作用蛋白,其中膜蛋白Ezrin可能在HBV感染致病过程中具有重要作用。结论:Ezrin蛋白能够与乙肝病毒表面抗原PreS1结合,其在HBV感染致病过程中的重要作用值得探索。