分子生物学技术讲座（二）——分子克隆中所用的酶

限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类：Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP的限制（切割）活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰（甲基化）酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依…     

限制性酶

核酸限制性内切酶是识别双链DNA中专一序列的酶,主要从原核生物中提取。限制性内切酶可分为三类:第Ⅰ和第Ⅲ类酶在同一旦白中具有修饰作用(甲基化作用)和需要ATP的限制性裂解的活性。这两种酶都识别底物DNA中非甲基化的序列,不过第Ⅰ类酶的作用是随机的,第Ⅲ类酶则切DNA的专一位点。     

丁酰苷菌素产生菌Bacillus circulans3342质粒pBCl的分离及其性质

在氨基寡糖类抗生素丁酰苷菌素的产生菌Bacillus circulans 3342中发现了一种质粒DNApBC1,其分子量为9.0×10~6道尔顿。 用限制性内切酶BglⅠ、SmaⅠ和Hind Ⅲ酶切这种质粒DNA,构成了pBC1的限制性内切酶图谱。selⅠ、SmaⅠ和Hind Ⅲ分别将这种质粒DNA切为2、2和5条片段,EcoRI则切为4条片段,而SalⅠ、Bam HI和Pv(?) Ⅱ不能切这种质粒DNA。     

中国昆明(KM)小鼠线粒体DNA限制性内切酶图谱的研究

线粒体DNA的限制性内切酶图谱在不同的种系及亚种间存在多态性。我们分别用五种限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅡ、HidⅢ、PstⅠ、MspⅠ对60只中国KM小鼠(雌雄各半)的线粒体DNA进行了酶切电泳分析,结果未发现多态性,且这五种限制性内切酶图谱均与BALB/c小鼠相同。这表明中国KM小鼠与绝大多数实验小鼠一样,均起源于欧州的野鼠M.m.domesticu。未见到KM小鼠经其它亚种野鼠母系遗传污染的迹象。     

中国东部栗疫病菌群体的遗传分化

本实验采用RFLP技术,对中国东部栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)进行了群体遗传结构的研究。313个参试菌株来自10个省(市)的16个群体(子群体),样本分布在北纬24°N—41°N。各菌株的DNA分别用限制性内切酶Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切,先后以10个低拷贝DNA探针和1个DNA指纹图谱探针进行了杂交和检测。结果表明,两个探针(pCB29和pMS29.1)的杂交图谱呈单态性;探针pCB19的杂交图谱显示,菌株DNA以PstⅠ酶切的为单态性,以EcoR Ⅰ酶切的则呈多态性;其他7个低拷贝探针的杂交图谱都呈多态性(Pst Ⅰ酶切)、指纹图谱探针的检测结果显示,辽宁凤城群体的菌株与中国东部其他群体的菌株相比,具有更多的限制性杂交片段,菌株间的遗传变异性也更大。     

中国东部栗疫病菌群体的遗传分化*

本实验采用RFLP技术,对中国东部栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)进行了群体遗传结构的研究。313个参试菌株来自10个省(市)的16个群体(子群体),样本分布在北纬24°N—41°N。各菌株的DNA分别用限制性内切酶Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切,先后以10个低拷贝DNA探针和1个DNA指纹图谱探针进行了杂交和检测。结果表明,两个探针(pCB29和pMS29.1)的杂交图谱呈单态性;探针pCB19的杂交图谱显示,菌株DNA以PstⅠ酶切的为单态性,以EcoR Ⅰ酶切的则呈多态性;其他7个低拷贝探针的杂交图谱都呈多态性(Pst Ⅰ酶切)、指纹图谱探针的检测结果显示,辽宁凤城群体的菌株与中国东部其他群体的菌株相比,具有更多的限制性杂交片段,菌株间的遗传变异性也更大。     

热带假丝酵母79线粒体DNA的研究

本文报道了热带假丝酵母线粒体DNA的分离纯化、性质和酶切图。此线粒体DNA用电镜观察有线状、开环状和闭环状三种形状;在氯化铯中浮力密度为1.691g/cm~3;解链温度为80.0℃。限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和PstⅠ在此线粒体DNA上分别有6、5和3个切点。根据酶切片段计算分子量为22.97×10~6道尔顿。同时,用双酶切方法得到此线粒体DNA的内切酶图谱。     

引起幼儿腹泻的腺病毒的实验室诊断

目的研究引起幼儿腹泻的腺病毒的型别。方法取因腹泻住院的幼儿粪便标本．经PCR检测为腺病毒F组(Ad40或Ad41)阳性后,用293细胞分离病毒并培养,当细胞发生典型病变效应,刮下细胞备用：(1)固定,送电镜室检测;(2)按照湖北中医学院检验系实验室常用的方法提取病毒DNA。用SmaⅠ和HindⅢ2种限制性核酸内切酶消化腺病毒DNA并与文献报道的Ad40和Ad41的酶切图谱比较。结果5例阳性标本的PCR产物的大小是519bp．电镜可见细胞核内腺病毒晶格状排列;并且SmaⅠ和HindⅢ的酶切图与文献报道的Ad41图谱一致。结论用PCR和限制性核酸内切酶组合方法检测肠道腺病毒是可行的。     

杨尺蠖核型多角体病毒的DNA特性

本文报道了AciNPV-DNA的纯化及特性,证明纯化DNA具有典型紫外吸收光谱,在Sepharose 2B柱层析和超离心沉降分析中呈单一峰,Tm值为70.2℃,其(G+C)％=39.8％,增色效应为34％,限制性内切酶Pst Ⅰ,PvuⅡ,SaI Ⅰ,Eco R Ⅰ,BgI Ⅰ,XhoⅠ,Bgl Ⅱ酶切DNA,分别产生4,6,22,20,11,5,7个DNA片段,某些酶切电泳图谱中观察到亚分子片段,Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ双醇切DNA分子产生26个片段,Eco R Ⅰ酶切片段积加DNA分子量为56.55×10~6道尔顿,约85.70千碱基对,电镜观察DNA分子有线状和环状,环状分子长约27.38μ,分子量约为53.94×10~(?)道尔顿,以Eco R Ⅰ对1981～1985年林间连续复制回收的AciNPV的DNA同源性进行检测,结果无变化,AciNPV攻毒枣尺蠖幼虫所得枣尺蠖NPV,其DNA的Bgl Ⅱ图谱与AciNPV-DNA的Bgl Ⅰ酶谱有明显的差异。     

谷氨酸产生菌噬菌体的限制性内切酶分型

噬菌体污染在全国各地味精厂广泛存在,严重的污染常导致发酵中期倒罐。肇致巨额经济损失,我们从上海,沈阳,山东、武汉等地味精厂发酵环境及异常发酵液中分离出多株噬菌体,鉴于目前常用的噬菌体的分型标准具有某些局限性,我们试用DNA的限制性内切酶谱来区分噬菌体的型别。根据3种指标分别对8株噬菌体分型:按限制内切酶Bam H Ⅰ和Pst Ⅰ图谱分为7型。按宿主范围分为2型-按形态特征分为5型,这些结果不仅说明限制性内切酶分型是比宿主范围、形态特征更为灵敏的指标,而且表明限制性内切酶Pst Ⅰ和Bam H Ⅰ作为对噬菌体的分型标准是可行和方便的。