SDF-1α基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的构建SDF-1α基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体,进而观察SDF-1α基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法用EcoRI内切酶从pMD-T18一SDF-1α重组载体中酶切分离SDF-1α基因的完整ORF,构建pEGFP-C1-SDF-1α的融合表达载体,脂质体转染COS-7细胞,并在荧光显微镜下观察表达的融合蛋白。结果SDF-1α基因在COS-7细胞中高效表达,激光共聚焦的结果显示,SDF-1α基因定位在细胞质内。结论成功构建了pEGFP-C1-SDF-1α的融合表达载体,SDF-1α基因主要在细胞质中表达。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1．2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPAl中含有α毒素全基因。随后用NcoI／EcoRI酶切质粒pXCPAl,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXAl,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXAl)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的16．28％。     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因的高效表达

用NooI/EcoRI酶切含α毒素基因质粒pXCPA02,回收1.2kb的α毒素基因片段,通过T4 DNA连接酶,将回收的α毒素基因片段与经NcoI/Eco RI酶切的表达载体pET-28c连接,转化至受体菌BI21(DE3)中,经NcoI/EcoRI,BamHI/Eco RI和NcoI/BamHI/Eco RI酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实,获得的表达质粒aXETA02含有α毒素基因,而且阅读框架是正确的.重组菌株BL21(DE3),(pXETA02)经IPTG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的36.83%.     

携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建

目的采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的重组腺病毒载体,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。方法将pTurbo RFP-N上的含红色荧光蛋白基因片段,经酶切连接定向克隆至转移载体pShuttle上,构成重组质粒pShuttle-TurboRFP-N。用I-CeuI/PI-SceI双酶切重组质粒pShuttle-TurboRFP-N和骨架质粒pH5′040 pkGFP-II,回收目的片段,连接,获得重组腺病毒载体pH5.′040.CMV.RFP-N。将其线性化后,经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒。通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包装效率和RFP表达情况。扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力,并测定其生物活性及滴度。结果经酶切鉴定,证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5.′040.CMV.RFP-N;经AD293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒,并能在真核细胞中高效表达目的基因;扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3.6×1012vp/mL,滴度达1×1010pfu/mL。结论成功构建了携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体,并能够在AD293细胞中高效地表达,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。     

变形链球菌F-ATPase启动子荧光蛋白载体的构建及表达

目的构建由质子移位膜ATP酶(membrane-bound proton-translocating ATPase,F-ATPase)启动子启动的绿色荧光蛋白报告基因穿梭表达载体,观察其在大肠埃希菌中的表达同时鉴定表达产物。方法以变形链球菌(UA159)基因组为模板,扩增F-ATPase启动子片段,构建由F-ATPase启动子启动的绿色荧光表达载体pFgfp,酶切F-ATPase启动子及绿色荧光蛋白编码基因,连接到穿梭质粒pDL276,构建重组载体pLFgfp。结果重组质粒pLFgfp酶切及基因序列分析证实目的片段成功插入,重组载体转化后的大肠埃希菌有绿色荧光蛋白的表达,并能随着细菌传代继续表达。结论 F-ATPase启动子启动的绿色荧光蛋白穿梭表达载体pLFgfp构建成功,为研究生物膜环境中耐酸菌F-ATPase毒力因子的表达奠定基础。     

表达增强绿色荧光蛋白重组乳酸菌的构建

以乳酸乳球菌通用表达载体pMG36e为基本骨架,将增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)插入该载体组成型表达强启动子p32的下游,构建了eGFP标记的乳酸菌表达载体pMG36e-eGFP。重组质粒电击转化一株乳酸乳球菌BLCC02-0018。筛选阳性转化子,通过连续荧光强度检测,验证eGFP基因能否在重组菌中稳定表达。重组表达质粒pMG36e-eGFP酶切及测序结果与预期片段大小相符,表明成功构建了重组乳酸菌表达载体pMG36e-eGFP;对阳性转化子进行蓝光激发,可见明显的绿色荧光,且荧光稳定性强,连续传代30代仍可见荧光,结果表明已经成功构建表达增强型绿色荧光蛋白的重组乳酸乳球菌,为下一步研究乳酸菌在动物体内的分布定殖规律打下了基础。     

绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞中的克隆与表达

将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到转移载体pVLneo的多角体蛋白基因(ocu)启动子下游,与杆状病素AcNPV DNA共转染昆虫细胞,通过同源重组和G418筛选,构建了整合有GFP基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的GFP,MW为30kDa,在荧光显微镜下呈现美丽的绿色,荧光光谱表明其激发波长395nm,发射波长509nm。Southern blot杂交证明,重组病毒的1kb EcoRI片段与GFP cDNA探针有很强的杂交信号,这是GFP基因在杆状病毒基因组中整合的直接证据。     

鼠PS1-GFP融合蛋白表达载体的构建研究

Presenilin1(PS1)的突变是早发家族性老年痴呆发生的重要因素之一。目前对于PS1结构和功能的研究表明,PS1作为一种多次跨膜并具有γ-secretase活性的蛋白酶,很可能参与众多的细胞信号传导通路,影响细胞分化和调亡、组织及个体的发育等等。但对于PS1的精细结构和功能目前了解甚少,为探讨PS1的精细结构和功能,本研究构建了鼠PS1-GFP融合蛋白表达载体。方法:我们设计了扩增PS1的cDNA全长的引物,以C57BL/6小鼠9天胚的RNA为模板,利用RT-PCR的方法从C57BL/6小鼠9天胚中获得PS1的cDNA,经测序确认后,将其克隆到pMD18-TVector中。设计引物:上游5’-GCCGAATTCTATGACAGAGATACCTGCACC-3’;下游5’-GAAGGATCCGATATAAAACTGATGGAATGC-3’,上游含有EcoRI酶切位点,下游含有BamHI酶切位点。利用高保真DNA聚合酶通过PCR方法将pMD18-T-PS1质粒中的PS1基因亚克隆到pEGFP-C1载体中,获得pEGFP-C1-PS1融合蛋白表达载体,然后利用EcoRI和BamHI从pEGFP-C1-PS1融合蛋白中切下PS1基因,从pMD18-T-PS1质粒中切下载体部分,经过连接,获得中间载体,利用该重组载体中的EcoRI和SalI酶切位点,酶切连接入pEGFP-N2载体中,获得pEGFP-N2-PS1融合蛋白表达载体,经测序鉴定后备用。     

C型产气荚膜梭菌β1毒素基因表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出β1毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI对其进行双酶切处理,回收0．95kb的β1毒素基因片段,最后将其定向克隆在事先经同样内切酶处理的载体pET-28c中相应位点上,转化至受体菌B121(DE3)qh。经BamHI和Eco RI双酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXBl含有B毒素基因,并且具有正确的基因序列和阅读框架。重组菌株BI21(DE3)(pETXB1)经IPIG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达β1毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的12．24％。     

大鼠大麻素Ⅰ型受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠大麻素型Ⅰ受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体并观察其在细胞中的表达。方法:大鼠CB1基因序列设计引物,以大鼠脑组织为模板扩增CB1基因编码区片段,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3中,构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,通过观察EGFP报告基因的表达以及免疫荧光,Western Blot方法鉴定CB1可在真核细胞中过表达情况。结果:构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP,单双酶切和测序验证正确。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞膜表达。免疫荧光试验也证明重组载体转染后,CB1基因和GFP共同定位于胞膜部分。Western Blot实验证明表达CB1蛋白。结论:成功构建了高表达的CB1-EGFP融合蛋白真核表达载体。     

一种基于EGFP的、安全的抗HIV药物评价系统

目的：建立基于EGFP的、安全的抗人免疫缺陷病毒（HIV）药物评价系统。方法：用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因替代HIV感染性克隆质粒pUC18-HIV-NL4-3中的部分包膜基因（env）,构建重组假病毒质粒pUC18-NL4-3-EGFP,将其与水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）真核表达载体共转染人胚肾293FT细胞,观察绿色荧光蛋白的表达,同时用该细胞培养上清进一步感染其他293FT细胞培养物。为了检验该假病毒系统能否用于抗病毒药物的评价,在假病毒复制和感染过程中加入不同浓度的抗HIV药物AZT（Zidovudine）,采用荧光显微镜检测和流式细胞仪定量检测,分析AZT对假病毒的抑制作用。结果：假病毒质粒pUC18-NL4-3-EGFP能够在转染细胞和再感染细胞中有效地表达绿色荧光蛋白基因,不同浓度的AZT能以剂量依赖方式抑制假病毒的感染和报告基因的表达。结论：建立了一种基于EGFP表达和检测的、安全的HIV假病毒复制和感染系统,该系统可以用于抗HIV药物的筛选和评价。     

人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达情况。方法：对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切（XhoI和BamHI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果：测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论：成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

SPC及EGFP共表达载体跟踪人羊水间充质干细胞体外定向分化

目的构建肺泡表面活性蛋白C(SPC)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体pcDNA3.1/SPC/EGFP,探讨其在体外跟踪人羊水间充质干细胞(AF-MSCs)定向分化为II型肺泡上皮细胞(AECII)的作用。方法采用PCR和DNA重组技术构建pcDNA3.1/SPC/EGFP表达载体,脂质体转染至AF-MSCs,G418稳定筛选;将AF-MSCs分为阴性对照组、未转染组和转染组,各组体外诱导培养后荧光显微镜观察SPC启动子调控下游EGFP基因表达活性,RT-PCR检测SPA和SPC mRNA表达水平,Western blot检测SPA和SPC蛋白表达以及电镜观察嗜锇性板层小体。结果成功构建pcDNA3.1/SPC/EGFP表达载体,测序结果与SPC启动子及EGFP序列一致;AF-MSCs体外诱导分化后,在阴性对照组中未见绿色荧光细胞,SPA和SPC mRNA及蛋白均为阴性表达,且未发现嗜锇性板层小体;在未转染组中亦未见绿色荧光细胞,而SPA和SPC mRNA(相对表达量为0.072±0.004和0.087±0.012)及蛋白(相对表达量为0.051±0.008和0.063±0.009)均为阳性表达,并发现嗜锇性板层小体;在转染组中可见绿色荧光细胞,SPA和SPC mRNA(相对表达量为0.109±0.011和0.126±0.017)及蛋白(相对表达量为0.075±0.012和0.081±0.006)均为显著表达,与未转染组相比差异均有统计学意义(t值分别为-5.50、-3.16、-2.90和-2.85,均P0.05),亦可见嗜锇性板层小体。结论经pcDNA3.1/SPC/EGFP表达载体转染的AFMSCs在体外适当诱导下能定向分化为AECII,pcDNA3.1/SPC/EGFP表达载体可能成为跟踪AF-MSCs定向分化的工具,为肺组织再生的干细胞治疗提供研究基础。     

信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA 蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响

[目的]构建绿色荧光蛋白(GFP)与禽流感病毒(AIV)HA基因的融合表达载体,观察信号肽序列的有无及位置对HA-GFP在293T细胞中的表达影响.[方法]应用PCR方法从H5N1亚型AIV质粒DNA中扩增出完整的或除去信号肽序列的HA基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和SmaⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的不同位点,将得到的重组体M1,M2和M3分别转化宿主菌DH5a,经双酶切及.DNA测序鉴定分析后,采用脂质体转染法将pEGFF-C1,M1,M2和M3转染人胚肾细胞系293T细胞,荧光显微镜下观察HA-GFP的表达,流式细胞仪检测表达HA蛋白的细胞百分数.[结果]经酶切及测序鉴定成功构建了HA-GFP重组表达载体M1,M2和M3,荧光显微镜及流式细胞仪检测到重组质粒转染的293T细胞表达强的荧光蛋白,信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达有显著影响,信号肽序列使HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达减少,而信号肽的位置对融合蛋白表达量的影响不显著.[结论]信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在细胞中的表达有显著影响.     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

绿色荧光蛋白在草鱼肾细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒pEGFP-N1转染到培养成单层的草鱼肾细胞（CIK）中,通过荧光倒置显微镜和特异性RT-PCR方法检测GFP的表达.在荧光倒置显微镜下可见CIK细胞的胞质和胞核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质.转染细胞中的转录产物经RT-PCR扩增后,凝胶电泳鉴定出与GFP基因片段分子量大小一致的条带,经测序证明其为GFP基因序列.结果表明,GFP基因可以在草鱼CIK细胞内高效率成功表达,为构建以GFP为报告基因的真核重组质粒及研究草鱼出血病DNA疫苗奠定了重要的基础.     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。