星豹蛛两个GST基因克隆、鉴定及其对溴氰菊酯胁迫的响应表达

【目的】为明确星豹蛛Pardosa astrigera体内2个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases, GSTs)基因的时空表达模式，并探究其是否能对溴氰菊酯的胁迫做出响应。【方法】基于星豹蛛转录组数据库，PCR克隆星豹蛛GST基因PaGSTd1和PaGSTd2全长cDNA序列并进行生物信息学分析；利用RT-qPCR检测PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛不同发育阶段(2-6龄若蛛和成蛛)、雌雄成蛛不同组织(头胸部、腹和足)以及通过药膜法利用不同浓度[LC₁₀(5.151 mg/L), LC₃₀(8.619 mg/L)和LC₅₀(12.311 mg/L)]溴氰菊酯胁迫不同时间(6, 12, 18, 24和48 h)雄成蛛中的表达量。【结果】星豹蛛PaGSTd1(GenBank登录号：OR096398)全长cDNA序列长708 bp,开放阅读框长645 bp,编码214个氨基酸；星豹蛛PaGSTd2(GenBank登录号：OR096399)全长cDNA序列长793 bp,开放阅读框长64...     

草菇葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶基因及其可变剪接体的克隆与表达量分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是戊糖磷酸途径的限速酶,影响着细胞生命活动所需要的NADPH的产生。本研究从草菇中克隆到该基因的2个转录本,并测定了它们在两个同核体和形成的异核体菌株中的表达量。结果表明,草菇葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(g6pdh)的g DNA序列长1 954bp,有7个内含子,可产生两个转录本:一个是内含子全部剪切的转录本(g6pdh ID),编码515个氨基酸且有完整结构域的蛋白质;另一个是第5个内含子保留的可变剪接变体(g6pdh IR),预测编码316个氨基酸但没有完整结构域的蛋白质。定量PCR结果显示,可变剪接变体g6pdh IR在草菇同核体与异核体中的表达量均很低,因此转录本g6pdh ID为g6pdh基因的主要剪接体;并且g6pdh基因在生长旺盛的异核体中的表达量远远高于在生长较弱的两个同核体中的任何一个。研究结论说明,糖代谢活动的强弱与食用真菌的生长与发育有密切关系。     

利用全长转录本优化柞蚕基因组注释(英文)

【目的】优化柞蚕Antheraea pernyi基因组注释,更好地扩展其在比较基因组学及品种改良研究中的应用。【方法】对柞蚕进行全长转录组测序分析;经全长转录本与参考基因组比对,鉴定新基因及新转录本,并对这些新基因和新转录本进行功能注释及长链非编码RNAs (lncRNAs)预测。利用大量的蛋白质编码转录本和lncRNAs对柞蚕基因组中基因结构进行修订。最后创建矫正后的柞蚕基因组基因注释。【结果】新发现1 997个蛋白编码基因和3 399个lncRNA基因,分别由2 402个和3 574个全长转录本数据支持。发现柞蚕基因组含25 021个基因,其中19 825个基因是蛋白编码基因,包括7个保幼激素酸甲基转移酶基因。【结论】本研究促进了对柞蚕基因组基因注释信息的认识,为柞蚕及相关物种功能基因组及比较基因组学研究提供了很有用的数据资源。     

草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的克隆及异源表达

【目的】克隆草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA,证实其编码的蛋白具有漆酶活性,最终建立草菇漆酶基因的异源表达及纯化体系。【方法】利用RACE技术克隆全长cDNA序列,并利用生物信息学技术进行序列分析,在此基础上,去除全长cDNA的编码信号肽的序列并在3'端添加His-tag碱基序列,把修饰后的cDNA片段克隆到表达载体pPIC9K上,并转化到毕赤酵母GS115中进行表达,对重组蛋白利用Ni柱进行分离纯化并以ABTS底物法检测重组蛋白的漆酶活性。【结果】vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA的长度分别为1599 bp和1554 bp,且分别含有19和15个外显子;其编码的蛋白的理论分子量分别是57.3 kDa和56.3 kDa,理论等电点分别为4.73和5.62,且都属于分泌型的胞外蛋白;表达出的重组蛋白RBvvlac1和RBvvlac6,其分子量大小约为70 kDa,说明存在翻译后修饰;含有150 mmol/L咪唑的缓冲液对RBvvlac1和RBvvlac6发酵液进行洗脱所得到的蛋白溶液具有最高漆酶活性(333.17 U/L和227.63 U/L)。【结论】草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6能够编码有活性的漆酶蛋白,本研究建立的异源表达及纯化体系适用于草菇或其它漆酶基因的异源表达与纯化。     

vv-2ogo,一个在草菇原基中高表达的基因

本研究结合草菇子实体不同生长时期的表达谱数据及荧光定量PCR分析结果,获得一个在原基高表达的基因,推测它与草菇原基时期子实体的生长分化有关。基因组注释结果显示它是一个编码2-OG依赖性氧合酶(2-oxoglutarate dependent oxygenases)的基因,系统发育分析也支持基因注释的结果,该基因被我们命名为vv-2ogo。转录组Reads定位结果表明,该基因全长1 451 bp,含有3个外显子,2个内含子,编码440个氨基酸,其中第二个内含子在RNA加工过程中有保留现象。     

苦荞谷胱甘肽转移酶(FtGST)基因的克隆与序列分析

采用RACE技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到一个谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase protein,FtGST)基因。序列分析表明,FtGST基因全长DNA序列和cDNA序列编码区分别为746 bp和666 bp,DNA序列含有一个长度为80 bp(342-421 bp)的内含子;开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸。生物信息学分析表明,FtGST基因推导的蛋白质含有Tau家族典型的底物结合口袋、谷胱甘肽结合位点(G-site)和疏水性底物结合位点(H-site)氨基酸残基,表明FtGST为Tau家族蛋白。     

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因BmGSTz1的克隆、序列分析及组织表达特征

谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是一个功能广泛的超基因家族, 其中Zeta家族在动物、植物和细菌中均有分布。在哺乳动物中, Zeta GSTs具有马来酰乙酰乙酸异构酶（MAAI）活性, 参与苯丙氨酸/酪氨酸的代谢过程。本研究对家蚕Bombyx mori基因组中预测的GST基因（BmGSTz1）进行了表达序列标签的搜索, 经拼接后获得一条含有3′和5′非翻译区在内的长度为1 239 bp 的cDNA序列, 其3′端含有AATAAA加尾信号。BmGSTz1基因含有4个内含子, 外显子/内含子边界均符合GT-AG 规则。经TA克隆证实, BmGSTz1基因编码区序列全长648 bp, 共编码215个氨基酸。BmGSTz1推定的分子量为24.8 kD, 等电点pI为8.06。BmGSTz1与其他昆虫和哺乳动物GSTz1的氨基酸序列高度保守, 进化分析表明家蚕BmGSTz1与黑腹果蝇Drosophila melanogaster、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、意大利蜜蜂Apis mellifera和赤拟谷盗Tribolium castaneum的GSTz1形成1∶1∶1∶1∶1的直系同源关系。RT-PCR和基因芯片数据表明BmGSTz1在家蚕5龄第3天幼虫各组织中都有表达。序列和组织表达特征分析结果提示家蚕BmGSTz1可能具有MAAI活性, 这将为进一步深入研究BmGSTz1基因的功能提供参考。     

烟夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆、序列分析与表达

为探明谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）在昆虫嗅觉识别中的作用, 本研究采用RT-PCR和RACE方法, 从烟夜蛾Helicoverpa assulta（Guenée）雄虫触角中克隆获得了1个GSTs基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为EU289223）。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性比对和系统发育分析, 发现该蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员, 因此将该基因命名为HaGSTe1。同时从烟夜蛾基因组DNA中克隆获得了该基因序列, 发现序列中含有5个内含子, 长度分别为415,513,296,333和269 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对HaGSTe1在雌、 雄虫不同组织的表达进行了定性和定量分析, 结果显示, 该基因在雌、 雄虫的头部（去掉触角和喙）、触角、喙、胸、足、翅以及雌虫的腹部均有表达, 并且在雄虫触角中的表达量最高, 且显著高于雌虫触角, 这种表达情况提示其可能与触角中性信息素及其他外源物质的分解有关。     

火把梨谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与表达

依据火把梨编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)的EST序列设计基因特异引物,采用快速扩增cDNA末端技术,从云南火把梨中克隆到一个新的GST基因的全长cDNA序列。该基因被命名为PpGST(GenBank登录号为HQ889136)。PpGST全长cDNA为1 177bp,具有130bp 5′-UTR、696bp ORF以及351bp 3′-UTR,编码含231个氨基酸的蛋白质。与已知植物GSTs家族成员间的氨基酸序列聚类分析将PpGST聚为zeta类GST。RT-PCR分析显示,PpGST在火把梨光照的果皮和没有光照的果皮中大量表达,并且表达强度不受光照时间的影响,而在幼嫩叶片中没有表达。研究结果暗示在果皮中大量表达的PpGST可能参与维持火把梨果实发育过程中的氧化还原平衡及应答逆境胁迫。     

大螟热激蛋白83基因克隆及序列分析

【目的】近年来,大螟Sesamia inferens(Walker)对水稻的为害逐渐加重并成为水稻的重要害虫之一。HSP83家族作为分子伴侣参与生物生长发育并对外界刺激产生响应,对生物功能蛋白质的正确折叠及胁迫信号传递有着重要意义。本研究旨在克隆大螟HSP90家族HSP83基因的c DNA及基因组全长序列,分析其基本特性。【方法】应用RT-PCR及RACE技术从大螟中克隆HSP83基因的c DNA序列;获取基因组序列,进行基因组验证,并与c DNA序列比较分析其有无内含子;进行系统发育分析。【结果】大螟HSP83基因被命名为Sihsp83(Gen Bank登录号:KM077137),长度为2 496 bp,开放阅读框长2 154 bp,编码717个氨基酸,推测分子量为82.6 ku。该基因编码的氨基酸序列中含有5个HSP90家族保守序列,在C-末端存在细胞质定位信号。大螟HSP83基因组序列长度为2 218 bp(Gen Bank登录号:KM077138),不含内含子。在系统发育树中,大螟HSP83与其他夜蛾科昆虫的HSP90家族聚为一支。【结论】获得的大螟HSP83基因是HSP90基因家族成员;大螟的HSP83是细胞质热激蛋白,具有很高的保守性。