17β-雌二醇对雄性唐鱼卵黄蛋白原的诱导及性腺发育的影响

以17β-雌二醇（E2）诱导雄性唐鱼产生卵黄蛋白原（Vtg）,采用Sephacryl S-300凝胶过滤层析柱提纯了雄鱼整体匀桨液的Vtg。结果显示,已确定被纯化的唐鱼Vtg在4%—7.5% Native—PAGE电泳中分子量为440 kD左右,能同时被考马斯亮蓝、糖蛋白、磷蛋白、脂蛋白染色方法同时染色,是一种富含糖、磷、脂的蛋白。与对照组作比较,17β-雌二醇暴露组其体重明显下降（P<0.01）,精巢发育滞后。结果表明,17β-雌二醇能够诱导雄性唐鱼产生大量的Vtg,并影响到其生长及精巢发育。雄性唐鱼Vtg可作为环境雌激素监测的有效生物学标记物。     

17β-雌二醇对剑尾鱼卵黄蛋白原的诱导研究

目的研究17β-雌二醇(E2)暴露对雄性剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵黄蛋白原(vitellogenin,Vtg)诱导作用作为环境风险评价(ERA)的有效生物学标记的可行性。方法以E2诱导的剑尾鱼雄性个体的整体匀浆液为材料,采用Sephacryl S-300凝胶过滤层析柱和QSepharose阴离子交换柱从剑尾鱼体内提纯Vtg。结果确定了被纯化的剑尾鱼Vtg在4%~7.5%Native PAGE电泳中相对分子质量为540×103。4%~7.5%Native PAGE电泳后的凝胶分别利用苏丹黑B进行脂蛋白染色、高碘酸-Schiff试剂进行糖蛋白染色和甲基绿进行磷蛋白染色,表明剑尾鱼Vtg是一种富含糖、脂、磷的蛋白。结论表明雄性剑尾鱼卵黄蛋白原的诱导变化可作为环境风险评价(ERA)的有效生物学标记。     

唐鱼卵黄蛋白原的ELISA检测方法的建立

目的探索建立唐鱼卵黄蛋白原的ELISA检测方法。方法以卵黄脂磷蛋白（Lv）抗血清为抗体,以纯化的Lv作为抗原建立间接酶联免疫吸附反应（ELISA）方法检测雄性唐鱼（Tanichthys albonubes）整体匀浆液中的卵黄蛋白原（Vtg）。结果利用ELISA方法测定了经17-β雌二醇（E2）和不同浓度DDTs暴露21 d诱导的雄鱼整体匀浆液中的Vtg含量,可以直接在1块或在不同的酶标板上准确地进行比较。经0.055 mg/mL E2诱导的雄鱼整体匀浆液中Vtg含量为4148.33μg/g;当暴露DDTs浓度为0.0275、0.0137和0.0067 mg/mL时,雄鱼整体匀浆液中Vtg含量分别为1109.43、911.16和1322.79μg/g,与丙酮溶剂对照组462.79μg/g比较差异存在显著性（P〈0.05）。结论建立了唐鱼卵黄蛋白原的ELISA检测方法 ,本方法的检测灵敏度为8.1 ng/mL,批内误差为8.59%,批间误差为6.28%,工作范围为3.26～209.25 ng/mL。在该范围内,标准曲线具有良好的线性和重复性。     

EE2对稀有鮈鲫和斑马鱼幼鱼体内卵黄蛋白原诱导的比较

利用卵黄蛋白原(Vtg)作为类雌激素污染的生物标志物,比较研究了不同浓度的17α-乙炔基雌二醇(EE2)对斑 马鱼(Brachydanio rerio)和稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)幼鱼体内Vtg的诱导。研究结果表明:5ng/L,20ng/L和100ng/L EE2分别暴露5d后,稀有鮈鲫幼鱼体内的Vtg即可显著诱导,并且其含量随暴露时间的增加而增加,在暴露15d时 达到最大值;而斑马鱼幼鱼虽然100ng/LEE2暴露5d时可显著诱导体内Vtg的生成,但20ng/L EE2在暴露10d后, 5ng/L EE2在暴露15d后,才可显著诱导斑马鱼体内Vtg的生成。这一结果说明EE2暴露下对稀有鮈鲫体内Vtg的 诱导要比斑马鱼敏感。     

唐鱼精巢的组织学观察

应用光学显微镜对唐鱼Tanichthys albonubes精巢的组织结构进行了观察.结果表明,唐鱼的精巢属于小叶型结构.性成熟唐鱼的精巢呈乳白色,长条状,左右各一,合并成“Y”型.小叶间质把精巢分成许多精小叶,每个精小叶由数个精小囊组成,精子就在精小囊中形成.同一精小叶内的精小囊不一定同步发育,但同一精小囊中的生精细胞发育是同步的.唐鱼的精子发生和形成过程经历了初级精原细胞、次级精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和成熟精子6个阶段.精巢内同时存在初级精原细胞和次级精原细胞两种类型的精原细胞.     

17β-雌二醇对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨17β-雌二醇对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及可能机制。方法:选取SH-SY5Y细胞传代培养,分为四组:(1)阴性对照组;(2)氧化损伤组:0.1 mmol·L~(-1)谷氨酸作用24 h;(3)17β-雌二醇低、高浓度组:加入(1.0×10~(-4) mmol·L~(-1)和1.0×10~(-3)mmol·L~(-1))17β-雌二醇作用24 h之后,加入谷氨酸作用24 h。采用MTT比色法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,Hoechst-PI染色观查细胞凋亡,分光光度计检测上清液中Caspase-3及Caspase-9含量。结果:7β-雌二醇能明显抑制谷氨酸诱导的细胞活性的下降,减少谷氨酸所致SH-SY5Y细胞内ROS的生成,降低细胞凋亡率,减少凋亡因子的活性。结论:17β-雌二醇对神经细胞损伤具有保护作用,这可能与其抗氧化作用有关。     

17beta-雌二醇对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨17β-雌二醇对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及可能机制。方法：选取SH-SY5Y细胞传代培养, 分为四组：(1)阴性对照组;(2)氧化损伤组：0.1 mmol·L-1谷氨酸作用24 h;(3)17β- 雌二醇低、高浓度组：加入(1.0× 10-4mmol·L-1和 1.0× 10-3 mmol·L-1)17β- 雌二醇作用24 h之后,加入谷氨酸作用24 h。采用MTT 比色法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞活 性氧(ROS)水平,Hoechst-PI染色观查细胞凋亡,分光光度计检测上清液中Caspase-3 及Caspase-9 含量。结果：7β- 雌二醇能明显 抑制谷氨酸诱导的细胞活性的下降,减少谷氨酸所致SH-SY5Y 细胞内ROS 的生成,降低细胞凋亡率,减少凋亡因子的活性。结 论：17β-雌二醇对神经细胞损伤具有保护作用,这可能与其抗氧化作用有关。     

雌性大熊猫发情期尿中17β—雌二醇与孕酮水平的变化及其与配种的关系

本文用放射免疫法测定了3头雌性大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)发情期尿中17β-雌二醇与孕酮水平的变化。大熊猫的发情行为与尿中17β-雌二醇浓度的变化密切相关。发情期中,随着孕酮水平下降的同时雌二醇水平却迅速上升并达峰值(28.2—65.5毫微克/毫克肌酐),然后再下降到基础水平。性活动最强烈的日期发生在17β-雌二醇最高峰值的当天或峰后一天。在雌二醇峰后,尿中孕酮水平逐步升高,发情后期的孕酮平均值显著高于发情前期(P<0.01)。本实验中,3头大熊猫均妊娠,说明自然交配或人工授精的适宜时间可根据雌性大熊猫尿中17β-雌二醇的监测予以确定。     

17β-雌二醇对雄性剑尾鱼精巢和肝发育的影响

用组织学的方法研究了50μg/L 17β-雌二醇(E2)持续50 d暴露对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)精巢和肝组织结构变化的影响.结果显示,剑尾鱼受E2暴露后,精巢内的精小囊数量减少,精原细胞发育停滞,精子数量稀少甚至没有;肝细胞胞质内出现脂肪空泡和脂肪沉积等脂肪肝症状.结果表明,E2具强雌激素效应,对剑尾鱼精巢和肝组织的损伤具有时间效应,随着暴露时间延长其损伤更严重,但都在其耐受范围之内,未造成鱼体的死亡.精巢组织结构损伤可作为检测水环境雌激素污染生物标记.     

NO信号途径在17β-雌二醇抑制大鼠VSMC ET-1生成中的作用

目的:用培养的血管平滑肌细胞(VSMC)探讨17β-雌二醇抑制内皮素-1(ET-1)生成的机制。方法:分别给予不同浓度的17β-雌二醇(10-9～10-7mol/L)或加入L-NAME作用VSMC不同时间,利用放免法测定ET-1的含量;同时检测ECE-1的活性以及preproET-1mRNA的表达。结果:17β-雌二醇可抑制基础状态下VSMCET-1的生成,其作用与ECE-1活性的改变无关;L-NAME可抑制17β-雌二醇的作用;RT-PCR结果显示,17β-雌二醇可以抑制preproET-mRNA的表达,而L-NAME可逆转17β-雌二醇所致preproET-1 mRNA表达的下降。结论:在基础状态下,17β-雌二醇可抑制VSMCET-1的生成,17β-雌二醇抑制ET-1的生成与ECE-1的活性改变无关,17β-雌二醇主要通过NO信号途径减低VSMCperproET-1 mRNA表达来抑制ET-1的生成。     

17β-雌二醇对雄性剑尾鱼生长发育的影响

用组织学的方法研究了50μg/L 17β-雌二醇(E2)持续50d暴露对剑尾鱼精巢、肝脏和鳃组织结构变化的影响,结果显示,剑尾鱼受E2暴露后,精巢内的精小囊数量减少,精原细胞发育停滞,精子数量稀少甚至没有;肝细胞胞质内出现脂肪空泡和脂肪沉积等脂肪肝症状;鳃丝和鳃小片出现不同程度的肿胀、增生、融合现象.结果表明,E2具强雌激素效应.对剑尾鱼精巢、肝脏和鳃组织的损伤具有时间效应,随着暴露时间延长其损伤更严重,但都在其耐受范围之内,未造成鱼体的死亡.精巢组织结构损伤可作为检测水环境雌激素污染生物标记.     

间苯二酚与邻苯二酚对泥鳅血清卵黄蛋白原的诱导作用

为探讨间苯二酚(m-dihydroxybenzene)与邻苯二酚(o-dihydroxybenzene)对雄性泥鳅Misgurnus anguillicau-datus血清卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)的诱导作用,将雄性泥鳅分别暴露于4种不同质量浓度间苯二酚(5.287mg/L、6.531mg/L、8.072mg/L、10.000mg/L)和邻苯二酚(16.708mg/L、17.742mg/L、18.836mg/L、20.00mg/L)中持续7d、14d、21d和28d,采用碱不稳定性蛋白结合磷法检测血清Vtg水平的变化。结果显示,与对照组相比,泥鳅在低质量浓度间苯二酚(5.287mg/L)和邻苯二酚(16.708mg/L)中暴露7d时,血清Vtg水平均有极显著升高,并且随着暴露浓度的增加,Vtg水平逐渐升高;在同一暴露浓度下,Vtg水平随暴露时间的延长逐渐升高;2种酚类化合物相比,暴露在间苯二酚中的泥鳅血清Vtg水平高于邻苯二酚。上述结果说明,2种化合物均可诱导雄性泥鳅肝脏合成Vtg,具有一定的环境雌激素效应,其诱导作用随着暴露剂量的增大和时间的延长逐渐增强。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中氧化17β-雌二醇的17β-羟甾类脱氢酶2及其转录调控因子AraC的鉴定（英文）

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2 (17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水平;我们在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中异源表达了17β-HSD2和AraC基因,并利用金属离子亲和层析法纯化获得了重组蛋白;我们体外表征了17β-HSD2的酶学性质,利用高效液相色谱鉴定了其产物;通过电泳迁移转移法和DNase酶I足迹试验,我们鉴定了重组蛋白AraC的结合能力与结合位点。[结果]17β-HSD2和AraC可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对结果表明17β-HSD2含有短链脱氢酶/还原酶(SDR)和β-羟甾类脱氢酶的保守结构与残基。该酶以NAD+为辅助因子,在C_(17)位点氧化17β-雌二醇,其K_m值为0.082 mmol/L,V_(max)值为56.26±0.02μmol/(min·mg);5 min内可转化97.4%以上的雌二醇。转录调控因子AraC可直接结合17β-hsd2基因启动子区的特异位点;雌二醇与雌酮可解除这一结合,启动17β-hsd2基因转录;过表达AraC蛋白可抑制17β-hsd2的转录。[结论]假单胞菌SJTE-1的17β-羟甾类脱氢酶2可高效催化17β-雌二醇转化,并受到转录因子AraC的直接调控。本工作可推进细菌的雌激素降解酶学机制与调控网络研究。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中氧化17β-雌二醇的17β-羟甾类脱氢酶2及其转录调控因子AraC的鉴定

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2(17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水平;我们在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中异源表达了17β-HSD2和AraC基因,并利用金属离子亲和层析法纯化获得了重组蛋白;我们体外表征了17β-HSD2的酶学性质,利用高效液相色谱鉴定了其产物;通过电泳迁移转移法和DNase酶I足迹试验,我们鉴定了重组蛋白AraC的结合能力与结合位点。[结果]17β-HSD2和AraC可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对结果表明17β-HSD2含有短链脱氢酶/还原酶(SDR)和β-羟甾类脱氢酶的保守结构与残基。该酶以NAD+为辅助因子,在C17位点氧化17β-雌二醇,其Km值为0.082 mmol/L,Vmax值为56.26±0.02μmol/(min·mg);5 min内可转化97.4%以上的雌二醇。转录调控因子AraC可直接结合17β-hsd2基因启动子区的特异位点;雌二醇与雌酮可解除这一结合,启动17β-hsd2基因转录;过表达AraC蛋白可抑制17β-hsd2的转录。[结论]假单胞菌SJTE-1的17β-羟甾类脱氢酶2可高效催化17β-雌二醇转化,并受到转录因子AraC的直接调控。本工作可推进细菌的雌激素降解酶学机制与调控网络研究。     

镉暴露对黑斑蛙精巢ROS的诱导及其蛋白质氧化损伤作用机理

重金属镉对精巢发育、呼吸及神经系统信号转导等途径均有不良影响,被认为是造成两栖动物种群数量急剧下降的重要原因之一。然而,有关镉对精巢损伤的分子机理还不清楚。通过对镉暴露后的黑斑蛙精巢活性氧自由基(ROS)、蛋白质羰基(PCO)以及DNA蛋白质交联(DPC)等指标的系统分析,探讨了镉对精巢毒害的分子作用机理。随镉浓度的增加,黑斑蛙精巢细胞线粒体ROS随镉暴露浓度的增加而升高,0.5、1.0 mg/L镉染毒组与对照组比较有显著性差异(P<0.05);精巢组织PCO和DPC也随镉暴露浓度的增加而逐渐上升,且均呈明显的浓度-效应关系。结果表明:镉诱导机体产生ROS,进而导致蛋白质氧化损伤以及DNA损伤,说明精巢组织ROS的产生是镉致雄性生殖毒效应机制的重要因素之一。     

鱼类染色体的观察

在早春到市场上买性成熟的活雄鲤一条,取其精巢(性腺已发育到第Ⅳ期),做染色体的观察。 1.固定将精巢放入Carnoy固定液(无水酒精3份,冰醋酸1份),固定3小时,再换入70％酒精中。 2.染色用镊子和解剖针仔细取出精巢内的精细小管(细如白发),一小段,放手掌上剔去周围异物之后,放置载玻片上,加醋酸洋红(45％醋酸100毫升加洋红1克煮沸、冷却、过滤即成),染色2-3小时。     

雌激素对培养心肌细胞肥大和凋亡的抑制作用

目的研究生理剂量17β雌二醇(17-βestradiol,E2)对去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)诱导的心肌细胞肥大和凋亡的影响。方法培养新生大鼠心肌细胞分别给予NE(50μmol)、E2(10nmol)、NE(50μmol) E2(10nmol)作用48h,通过心肌细胞蛋白质含量、[3H]亮氨酸掺入率检测心肌细胞肥大;透射电镜、DNA Ladder和流式细胞术检测心肌细胞凋亡。结果17β雌二醇可抑制去甲肾上腺素诱导的心肌细胞蛋白质含量、[3H]亮氨酸掺入率和心肌细胞凋亡率的增加,使凋亡心肌细胞特异性超微结构和DNA梯状带纹消失。结论17β雌二醇可抑制去甲肾上腺素所诱导的心肌细胞肥大和凋亡。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中转化17β-雌二醇的3-酰基-ACP还原酶的鉴定与功能研究（英文）

【目的】假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚。本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶(ANI01589.1),并对其进行了功能研究。【方法】首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白。体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定了该酶的催化产物。【结果】3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6mg/L。蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶(SDR)的2个共有区域和多个保守残基。该酶以NAD~+为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其Km值为0.071 mmol/L, k_(cat)值为2.4±0.06/s~(–1),5 min内可转化超过95.8%的雌二醇。该酶的最佳反应温度为42°C,最佳pH为8.0。不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg~(2+)和Mn~(2+)可增强其酶活性。【结论】这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用。     

DEHP对中国林蛙精巢中StAR、CYP17和CYP19基因表达的影响

为探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)对两栖动物精巢类固醇激素合成的影响,将中国林蛙(Rana chensinensis)雄性成体分别暴露于浓度为10-7、10-6、10-5、10-4mol·L-1DEHP的水体,分别在暴露20、30和40d取其精巢,提取精巢总RNA,逆转录合成cDNA,通过荧光实时定量PCR检测StAR、CYP17和CYP19mRNA表达相对值。结果表明:与对照组相比,DEHP处理组StAR和CYP19基因表达均上调,CYP17基因表达下调;比较不同DEHP浓度和不同暴露时间对StAR、CYP17和CYP19mRNA表达相对值的影响,显示DEHP浓度变化对3个基因表达影响的规律性不强,而DEHP暴露时间的累积效应较明显;提示DEHP可通过干扰中国林蛙精巢中StAR、CYP17和CYP19基因表达,影响其相应关键酶的表达,从而干扰类固醇激素的合成,产生雌激素效应。     

长江江豚精巢发育和组织学特征的研究

性成熟的江豚精巢明显增大,其重量约为成熟前的14倍,结合有关江豚捕捞和野外生态学资料,初步认为长江江豚属多雌性群体,而成熟的雄性个体具有较大的精巢,可能对保证群体的成功繁殖非常重要。根据精巢的组织学特征,可将江豚精巢发育分为胚胎早期、胚胎晚期、成熟前期和成熟期(包括活动期和不活动期),通过对精巢生精小管管径大小和白膜厚度进行分析,认为成熟江豚精巢活动呈季节性变化。