伊红、台盼蓝检测河蟹精子存活率的比较

对台盼蓝和伊红染色法检测河蟹(Eriocheir sinensis)精子存活率的方法进行了评价研究。结果表明,两种染色法死、活精子分别呈现出明显不同的染色特征:活精子无色透明,顶体中央凸起呈圆锥状,光镜下辐射臂及细胞边界清晰;死亡精子顶体着色,且中央有一染色较深的圆斑,核杯染色不明显,细胞体积变大,边界模糊。通过不同染色时间和不同染料浓度的比较发现,两种染色法最适染液浓度分别是0·25%的伊红和0·5%的台盼蓝,染色时间均以15min为佳。在此基础上,将新鲜精子和60℃水浴处理致死精子以不同的体积比混合,配成含致死精子比例为10%～90%的9个梯度样品,用伊红和台盼蓝分别测定各样品精子死亡率,并进行相关性分析。结果发现,各样品实测精子死亡率均略高于样品的理论死亡率,同时两种染色法实测值与样品理论值呈显著正相关(P<0·05),两种染色法之间亦呈显著正相关(P<0·05)。上述结果表明,伊红和台盼蓝可用于河蟹精子的活体染色,且两种染色法在对河蟹精子染色中具有一定的稳定性和可比性。     

5种常见珍珠贝的系统发育和遗传多样性分析

利用RAPD标记分析了珠母贝属常见的马氏珠母贝、大珠母贝、珠母贝、解氏珠母贝以及珍珠贝属常见企鹅珍珠贝的系统发育,同时分析了马氏珠母贝和大珠母贝不同地理种群的遗传多样性,并以邻接法(neighbor-joining,NJ)构建了种间及种群间的系统分支图.结果表明:(1)在珍珠贝5种9个种群中,大珠母贝的4个种群最早聚在一起分别成为2个姊妹群,这2个姊妹群聚合为1个单元群后,又与珠母贝聚在一起,然后才与马氏珠母贝姊妹群聚合成的单元群聚合,再与解氏珠母贝聚合,最后才与企鹅珍珠贝聚合;(2)珠母贝属4种珍珠贝进化程度由低到高的等级顺序为解氏珠母贝-马氏珠母贝-珠母贝-大珠母贝;解氏珠母贝是最晚形成的种类;(3)比较5种珍珠贝野生种群的Nei's多样性和Shannon多样性值为:马氏珠母贝(0.411 1和0.593 3)>珠母贝(0.397 1和0.578 4)>企鹅珠母贝(0.383 1和0.549 3)>大珠母贝(0.338 8和0.499 9)>解氏珠母贝(0.301 6和0.445 2);(4)无论是马氏珠母贝,还是大珠母贝,野生种群的遗传多样性值均大于养殖种群.     

缺氧与饥饿对马氏珠母贝滤水率和耗氧率的影响

为了揭示缺氧和饥饿对马氏珠母贝的生理能量学的影响,设置对照组、缺氧组、饥饿组、缺氧且饥饿组,处理12 h后连续5 d分析滤水率与耗氧率,结果显示缺氧和饥饿都显著影响马氏珠母贝的滤水率(p0.05),但是缺氧和饥饿对马氏珠母贝的滤水率不存在显著交互作用(p0.05);无论是缺氧还是饥饿均对对马氏珠母贝的耗氧率没有显著影响(p0.05),而且缺氧和饥饿对马氏珠母贝的耗氧率也没有交互作用(p0.05)。     

沉积再悬浮颗粒物对马氏珠母贝摄食生理影响的室内模拟

采用实验生态学方法室内模拟研究了不同浓度沉积再悬浮颗粒物对马氏珠母贝清滤率、摄食率、吸收率的影响。结果表明:(1)水体中总悬浮颗粒物对马氏珠母贝清滤率的影响极显著(P<0.01)。总悬浮颗粒物由低浓度(12.6 mg/L)趋高浓度(500 mg/L)时,马氏珠母贝的清滤率呈现峰值变化规律。与总悬浮颗粒物浓度50 mg/L时的最大清滤率(1.12 L.个体-1.h-1)比较,悬浮颗粒物浓度为500 mg/L时,清滤率达最小值(0.17 L.个体-1.h-1)),其清滤率降幅达85%。这表明在高浓度悬浮颗粒物的水环境下,贝类受到环境胁迫,其生理和自身摄食机制受到限制,引起摄食减少和机体损伤。马氏珠母贝类的清滤率(CR)与总悬浮颗粒物浓度(TPM)之间的关系可表达为:CR=-0.701+1.627×TPM-0.463×TPM2+0.036×TPM3(R2=0.928)。(2)水体中总悬浮颗粒物对马氏珠母贝摄食率的影响极显著(P<0.01)。马氏珠母贝的摄食率随着总悬浮颗粒物浓度的升高而增加,在50 mg/L时达最大值(38.28 mg/h),当总悬浮颗粒物浓度超过50 mg/L时,摄食率反而下降,在总悬浮颗粒物浓度为500 mg/L时,降为最小值(16.22 mg/h),摄食率降幅为58%。随着悬浮颗粒物浓度的增加,马氏珠母贝摄食率受到的影响小于清滤率受到的影响。马氏珠母贝类的摄食率(IR)与总悬浮颗粒物浓度(TPM)之间的关系可表达为:IR=-46.631+70.957×TPM-18.385×TPM2+1.367×TPM3(R2=0.907)。(3)水体中总悬浮颗粒物对马氏珠母贝吸收率影响极显著(P<0.01)。总悬浮颗粒物由低浓度(12.6 mg/L)趋高浓度(500 mg/L)时,马氏珠母贝的吸收率呈逐渐下降趋势,在总悬浮颗粒物12.6 mg/L时,马氏珠母贝的吸收率最大(48.57%),而总悬浮颗粒物500 mg/L时,马氏珠母贝的吸收率最小(8.56%)。马氏珠母贝的吸收率(AE)与总悬浮颗粒物浓度(TPM)之间的关系可表达为:AE=52.189+0.132×TPM-3.111×TPM2+0.316×TPM3(R2=0.976)。     

用曙红B活体染色法区别大鼠死活精子

在雄性生殖生理研究中,有人用曙红Y-黑色素(eosin Y-nigrosin)活体染色法评价存活精子的百分率。此法可以判断人精子是否存活,但不适于大鼠精子的判断。 本文扼要介绍我们摸索的判断大鼠精子死活的一     

温度、盐度对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量的联合效应

采用中心复合设计和响应曲面分析法,在实验室条件下研究了温度(16 ～40℃)、盐度(10 ～50)对马氏珠母贝鳃热休克蛋白Hsp70基因表达量的联合效应.设定温度范围为16～40℃,盐度范围为10～50.结果表明:温度的一次效应、二次效应对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量影响显著;盐度的一次效应对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量无显著影响、二次效应对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量影响显著,温度、盐度之间的互作效应对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量无显著影响,且温度的效应大于盐度.建立了马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量模型方程,决定系数98.7％、矫正决定系数97.4％,预测决定系数89.2％,模型的拟合度极高,可用于预测马氏珠母贝鳃Hsp70基因的表达量.通过对模型方程优化,得到在温度26.78℃、盐度29.33时,马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量达到最小值0.5276,满意度达到98％.试验结果可为马氏珠母贝鳃Hsp70基因的上调表达、维持细胞内环境稳定以及提高马氏珠母贝抗逆性提供理论指导.     

马氏珠母贝前列腺素E合酶2基因PGES-2的克隆与表达分析

前列腺素E合酶2 (prostaglandin E synthase, PGES-2)是一种核周蛋白,是前列腺素E_2(prostaglandin E_2, PGE_2)合成的末段限速酶之一。研究发现,PGES-2通过与上游诱导酶偶合形成通路调节PGE_2产生方式参与有机体炎症反应、神经系统疾病、促进组织溃疡等各种病理生理事件。为探索马氏珠母贝前列腺素E合酶2 (Pinctada fucata martensii, Pm-PGES-2)的序列特征及其表达情况,本实验通过RACE技术克隆出马氏珠母贝PGES-2基因的cDNA全长序列(Pm-PGES-2),并通过生物信息学软件分析该序列的功能结构;运用实时荧光定量技术检测马氏珠母贝PGES-2基因在各组织中的相对表达量。实验结果显示马氏珠母贝PGES-2基因cDNA序列全长1 419 bp,其中开放阅读框993 bp,编码330个氨基酸,非翻译区5 UTR长170 bp,3 UTR长256 bp。荧光定量PCR检测结果显示该基因在肝胰腺中表达量最高,鳃、边缘膜次之,各组织表达量差异具统计学意义(p0.05)。本研究为进一步探究PGES-2在马氏珠母贝中的生物学功能提供研究基础。     

温度、盐度对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量的联合效应

采用中心复合设计和响应曲面分析法,在实验室条件下研究了温度(16～40 ℃)、盐度(10～50)对马氏珠母贝鳃热休克蛋白Hsp70基因表达量的联合效应.设定温度范围为16～40 ℃,盐度范围为10～50.结果表明: 温度的一次效应、二次效应对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量影响显著;盐度的一次效应对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量无显著影响、二次效应对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量影响显著,温度、盐度之间的互作效应对马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量无显著影响,且温度的效应大于盐度.建立了马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量模型方程,决定系数98.7%、矫正决定系数97.4%,预测决定系数89.2%,模型的拟合度极高,可用于预测马氏珠母贝鳃Hsp70基因的表达量.通过对模型方程优化,得到在温度26.78 ℃、盐度29.33时,马氏珠母贝鳃Hsp70基因表达量达到最小值0.5276,满意度达到98%.试验结果可为马氏珠母贝鳃Hsp70基因的上调表达、维持细胞内环境稳定以及提高马氏珠母贝抗逆性提供理论指导.     

马氏珠母贝珍珠层形成相关基因的克隆与功能研究

作为世界上最重要的南洋珍珠生产基地,印度尼西亚(以下简称印尼)的产量占世界产量的50%以上。南洋马氏珠母贝珍珠由于光泽度好、晶莹剔透以及质感细腻等闻名于世。本文首先对马氏珠母贝进行了简单的介绍,然后分析了贝壳机制蛋白、珍珠层以及珍珠囊的研究现状,并对马氏珠母贝的BMP7基因与TIMP基因的克隆和功能研究做了简单的概述。     

马氏珠母贝维生素D受体介导维生素D3对PCaβ基因表达的调控

维生素D受体(VDR)是一种核激素受体,在介导维生素D调节机体钙-磷代谢、参与骨形成和矿化以及骨代谢等方面发挥重要作用。本实验克隆获得马氏珠母贝维生素D受体(Pm-VDR)编码区,检测其在不同组织中的表达模式,并分析维生素D3(VD3)刺激后Pm-VDR和马氏珠母贝L-型电压依赖性钙通道(PCaβ)基因的表达,探究Pm-VDR在马氏珠母贝生物矿化过程中的作用。结果显示:Pm-VDR开放式阅读框(ORF)为1407bp,编码468个氨基酸;相对分子量为53871.17kD,等电点为6.19;脂溶性系数为68.14,总平均亲水性为-0.70,属于亲水性蛋白。Pm-VDR具有由两个锌指结构组成的DNA结合域和一个激素受体的配体结合域。多序列比对结果显示Pm-VDR在物种之间具有较高的保守性,与长牡蛎同源性最高。qRT-PCR分析发现Pm-VDR在马氏珠母贝肝胰腺和鳃中表达量显著高于其他组织,其中肝胰腺的表达量最高。在0.2%、2%、20%浓度的VD3刺激12h后,Pm-VDR和PCaβ基因在鳃中表达量均显著上调(p0.05),上调的最低浓度分别为2%和0.2%。综上所述,Pm-VDR可能通过介导VD3调控PCaβ基因的表达参与马氏珠母贝鳃组织对Ca2+的吸收过程,从而调控贝体的生物矿化。     

马氏珠母贝Sox11基因的克隆及时序表达模式分析

为探究Sox(SRY-related HMG-box genes)基因家族在马氏珠母贝个体发育及性别分化中的作用, 研究首先利用兼并引物从马氏珠母贝基因组中克隆到一个HMG框(high mobility group box), 利用RACE-PCR技术从SMART cDNA文库中克隆到一个Sox基因的cDNA全长, 通过Clustal X和MEGA 4软件对该序列进行比对分析并构建系统进化树; 通过荧光定量PCR技术对该基因在不同组织及发育不同时期性腺中的表达情况进行分析。结果显示, 马氏珠母贝该Sox基因的cDNA全长为1579 bp, 其中开放阅读框(ORF)为1008 bp, 编码336个氨基酸, 5'非编码区为126 bp, 3'非编码区为445 bp。同源性分析表明, 马氏珠母贝Sox基因与太平洋牡蛎Sox11基因的同源性(Identity)最高, 为80%, 故命名为pmSox11; 系统进化树分析也显示pmSox11与太平洋牡蛎Sox11基因的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析组织表达特异性显示, pmSox11在马氏珠母贝神经节分布较多的组织如外套膜、鳃、足、消化盲囊等大量表达, 在神经节相对较少的闭壳肌和卵巢中表达量较少; 时序表达图谱显示, pmSox11在3月龄幼贝性腺和1年龄发育早期精巢中表达量最高, 在2年龄成熟精巢和2年龄性转换性腺中表达量降低, 而在2年龄卵巢中表达量最低。研究表明, pmSox11基因可能在马氏珠母贝早期神经系统发育和性别发育的调控方面起到重要作用。     

荧光法快速检测活菌数的方法研究及应用

【背景】Calcein UltraGreen~(TM)AM是一种新型荧光染料,用于标记和监测活细胞。【目的】基于该荧光染料的荧光特性及其在活细胞内的稳定特性,建立一种荧光定量快速检测活细菌总数的方法,并在实际样品中应用校正。【方法】通过应用荧光染料对细菌进行染色,再进行荧光强度检测,同时以平板计数法作平行对照,建立荧光强度值-活菌数标准曲线。【结果】确定了染色细菌的最佳pH值为8.0。该检测方法仅需固定染色温度,染色时间在20-30min范围即可快速检测。建立了革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌NY3、大肠杆菌和革兰氏阳性菌芽孢杆菌、红平红球菌FF、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的细菌总数与相对荧光强度值标准曲线。当菌悬液OD600值在0.01-0.30范围内时,上述6种细菌与荧光信号强度呈良好的线性关系(R20.99)。【结论】当样品菌悬液浓度范围控制在105-109CFU/mL时,建立的荧光检测方法快速便捷,精密度、重复性、稳定性、回收率和准确度均较好,可应用于微生物实验、固体菌剂发酵、食品卫生与安全、环境检测等领域的活细菌总数现场快速检测。     

合浦珠母贝珍珠的生物学性能初步检测

本研究报道了合浦珠母贝珍珠的生物学性能初步检测结果。珍珠作为—种天然的生物材料。在医药、化妆品工业等领域中的应用已很广泛。本研究对合浦珠母贝珍珠进行了体外细胞毒性试验、溶血试验和经静脉全身急性毒性试验的研究。实验结果表明,合浦珠母贝珍珠具有较好的细胞相容性,其浸提液对实验动物无明显毒性。在本研究中,合浦珠母贝珍珠的浸提液对兔血红细胞的溶血指数高于对照组。     

马氏珠母贝SRF基因的分子特征及组织特异性表达

血清反应因子(SRF)是一个高度保守的转录因子,在细胞增殖、细胞凋亡以及免疫反应中发挥重要作用。为了探究血清反应因子在马氏珠母贝中的生物学功能,本研究运用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到马氏珠母贝SRF基因(Pm SRF)c DNA的全长序列,并且应用实时荧光定量PCR技术对Pm SRF基因在马氏珠母贝不同组织中的表达进行检测。结果显示,Pm SRF基因序列全长1 758 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 440 bp,编码479个氨基酸,5'UTR为65 bp,3'UTR为253 bp,包含29 bp的poly A。预测其相对分子量为50 534.6 Da,理论等电点为7.71。多序列比对结果发现物种间SRF具有较高的保守性。SMART软件分析显示Pm SRF具有典型的MADS结构域。荧光定量PCR数据分析表明,Pm SRF基因在马氏珠母贝闭壳肌、肝胰腺、血细胞、外套膜、性腺、鳃六种组织中均有表达,其中在鳃中表达量最高。本研究可为进一步探究Pm SRF在贝类中的生物学功能提供重要的理论基础和参考价值。     

马氏珠母贝TLR13基因的克隆与组织表达分析

TLR13(Toll like receptor 13)是一种TLR模式识别受体,属于TLR11家族,在机体抵抗细菌、真菌、病毒和寄生虫的感染过程起重要的作用。为研究马氏珠母贝TLR13(PmTLR13)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,本研究采用RACE扩增技术获得了PmTLR13基因cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测PmTLR13基因在马氏珠母贝7个组织中的表达模式。结果显示,Pm TLR13基因序列全长2 750 bp,其中5'UTR长为25 bp,3'UTR长为34 bp,开放阅读框(ORF)为2 106 bp,编码701个氨基酸,预测其分子量约为81.22 kD,等电点为8.77。SMART分析结果显示PmTLR13具有富含亮氨酸的重复序列(LRRs)、TIR域、跨膜域和信号肽,符合典型的TLR家族特征;多序列比对结果表明物种间TLR13具有较高的保守性;RT-PCR数据分析表明,PmTLR13基因在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞、中央膜区、边缘膜区中均有表达,其中鳃中表达量最高,其次是外套膜边缘区和肝胰腺。研究结果表明,PmTLR13可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。     

合浦马氏珍珠母液生物活性成分的检测

目的研究合浦马氏珠母贝提取的珍珠母液,对其主要活性成分进行检测分析。方法采用《中华人民共和国国家标准》中的食品氨基酸、牛磺酸和微量元素的测定方法进行检测。结果合浦马氏珠母贝提取的天然珍珠母液含有丰富的活性物质（氨基酸总含量为223．7mg／100ml、牛磺酸总含量为276．4mg／100ml）和多种微量元素（锌、铜、铁、镁、钙等）。结论从马氏珠母贝中提取的天然珍珠母液有潜在的多领域应用和综合开发价值。     

大鲵精子结构研究

为了解大鲵精子超微结构,应用扫描电镜和透射电镜开展了大鲵精子形态结构研究。结果显示:大鲵精子由头部、颈部和尾部3部分组成。精子总长216.36μm±9.93μm(n=30),头部长65.80μm±3.70μm(n=30),颈部较短,多不明显,尾部长153.52μm±3.22μm(n=30)。头部由顶体、穿孔器和细胞核组成;颈部包括核窝、近端中心粒及远端中心粒、线粒体、轴丝和轴纤维;尾部无明显分段,由轴丝、轴纤维、轴丝旁纤维和波动膜组成。大鲵精子内线粒体较少,可能与精子运动缓慢、精子活力维持时间短有关;成熟过程中精子细胞头部包围的胞质分泌物中含有一定数量的线粒体。     

马氏珠母贝PmCOLVIA6基因的克隆和表达分析

collagenⅥ(COLⅥ)是胶原蛋白家族的重要成员,广泛分布于动物体细胞外基质,在脊椎动物骨骼形成过程中发挥重要作用。为了探究COLⅥ在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究运用聚合酶链式反应(PCR)和c DNA末端快速扩增技术(RACE)获得了马氏珠母贝Pm COLVIA6基因的全长序列,克隆获得其启动子区域,并对其蛋白结构进行了分析。荧光定量PCR技术检测了该基因在马氏珠母贝各个组织的表达量分布,并利用原位杂交技术检测Pm COLVIA6基因在外套膜的表达定位。结果表明:Pm COLVIA6序列全长为2 100 bp,开放阅读框(ORF)长为1 875 bp,编码624个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长56 bp,3'非翻译区(3'UTR)长169 bp,于5'调控区克隆得到长为1 826 bp的序列,可能存在4个启动子序列。Pm COLVIA6蛋白含有典型的v WA结构域,但三股螺旋结构缺失。荧光定量分析表明Pm COLVIA6基因在马氏珠母贝的各个组织均有表达,而在珍珠囊和外套膜中央区的表达量显著高于其它组织。原位杂交结果显示Pm COLVIA6的m RNA主要分布于外套膜中央区的外表皮细胞。综上所述,Pm COLVIA6可能参与马氏珠母贝珍珠层的形成。     

大鲵精子的超微结构研究

本文运用透射电镜和扫描电镜研究了大鲵(Andrias davidianus)精子的超微结构,大鲵精子由头部(head),中片(midpiece)和尾部(tail)三部分组成。头部有棒状细胞核,核内染色质高度浓缩,细胞核前方呈细丝状,但非顶体结构。头部后端凹陷,称为植入窝(implantation fossa),植入窝内有线粒体和中心粒等细胞器结构,此区域为精子的中片。精子尾部细长,主要由轴丝和附属纤维(accessory fiber)组成,轴丝的外面具有波动膜。     

马氏珠母贝磺基转移酶PmCHST9基因的分子特征与表达分析

糖胺聚糖在抗病毒、消炎和抗氧化等免疫反应发挥重要作用。磺基转移酶(sulfotransferase)是糖胺聚糖生物合成的关键酶,Carbohydrate sulfotransferase 9(CHST9)可以将磺酸基从3'-磷酸腺苷酰-5'磷酸硫酸盐(PAPS)转移到半乳糖残基非还原末端的4位碳上。为研究CHST9在马氏珠母贝免疫调节中的作用,本研究克隆得到马氏珠母贝CHST9(Pinctada martensii CHST9,Pm CHST9)c DNA全长序列并检测其在不同组织中的表达模式。利用RACE技术,得出Pm CHST9序列全长1 388 bp,其中5'UTR为122 bp,3'UTR为192 bp,开放阅读框(ORF)为1 074 bp,编码357个氨基酸;Pm CHST9氨基酸序列分子量为42 889.2 Da,等电点为9.28,脂溶性系数为81.32,总平均亲水性为-0.493;氨基酸序列分析得出Pm CHST9具有典型的磺基转移酶-2结构域和一个跨膜结构域;多序列比对结果显示Pm CHST9与其它物种的CHST9同源性较低;荧光定量PCR检测结果表明Pm CHST9在鳃中表达量最高,其次是足和肝胰腺。综上所述,Pm CHST9可能参与马氏珠母贝的免疫调节作用,为进一步阐述Pm CHST9在马氏珠母贝中的免疫机制提供基础资料。