当归多糖减轻5-氟尿嘧啶对骨髓基质细胞成骨分化的抑制

该实验探讨当归多糖(ASP)对改善5-氟尿嘧啶(5-FU)所致人骨髓基质细胞成骨与成脂分化失衡的作用。人骨髓基质细胞株HS-5体外培养分为:对照组、ASP组、5-FU组、5-FU+ASP组和5-FU+LiCl组。CCK-8检测细胞抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡;成骨与成脂诱导分化实验检测细胞成骨与成脂分化能力,Western blot检测Runx2、PPARγ和β-catenin蛋白表达,RT-PCR检测Runx2、OCN、BMP-2、Osterix、PPARγ和β-catenin mRNA表达。结果表明,与对照组相比5-FU作用HS-5细胞后细胞增殖抑制、凋亡率增加,成骨分化能力减弱、成脂分化能力增强,分化相关信号β-catenin蛋白和mRNA表达降低;相比5-FU组,ASP预处理可减少细胞凋亡;恢复细胞成骨分化能力,成骨相关因子Runx2、OCN、BMP-2和Osterix表达升高;降低细胞成脂分化能力,成脂相关因子PPARγ表达减少;β-catenin信号分子表达增加。结果提示,当归多糖可维持5-FU作用后骨髓基质细胞朝成骨方向分化的能力,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

二十二碳六烯酸增强MDA-MB-231细胞对5-FU敏感性的研究

目的:探讨二十二碳六烯酸(DHA)对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与凋亡的作用及对Wnt/1β-Catenin信号传导通路的影响.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT),测定DHA对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖活性的作用;应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;RT-PCR检测MDA-MB-231细胞β-catenin、GSK-3β基因的表达情况;Western blot检测MDA-MB-231细胞3-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白的表达情况;细胞免疫组化染色观察DHA及DHA联合Licl对3-Catenin蛋白细胞内表达及定位的影响.结果:20 μg/ml、40μg/ml的DHA分别与5-FU联合应用,可增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用.DHA(20 μg/ml)能促进5-FU增强MDA-MB-231细胞G0/G1期阻滞作用、降低细胞增殖指数及诱导细胞的凋亡.DHA作用于MDA-MB-231细胞后,β-catenin基因及蛋白表达水平下降(P＜0.05)、GSK-3β的基因及蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05),磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白表达水平下降(P＜o.05).结论:DHA能增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制和诱导凋亡,起化疗增敏作用,可能与其通过抑制GSK-3β磷酸化来阻断Wnt/β-Catenin信号通路有关.     

Wnt/β-catenin信号通路对细胞凋亡和坏死的调控研究进展

Wnt信号通路是一条与细胞增殖分化和机体平衡密切相关且高度保守的信号通路,主要包括Wnt/β-catenin信号通路、Wnt-Ca2+信号通路和平面细胞极性信号通路。其中,以经典Wnt/β-catenin信号炎性反应和细胞命运方面的研究最为深入。现已证实,Wnt/β-catenin信号对细胞命运的调控作用具有两面性,不仅通过调节Survivin、Cyclin、C-myc等基因的表达抑制一些肿瘤细胞凋亡,而且可通过上调促凋亡蛋白BIM、Bax和下调抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-xl的表达量来促进细胞凋亡。同时,该信号还可以通过抑制某些炎性因子的过度分泌,并下调活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量及坏死相关蛋白PARP-1的表达来抑制细胞坏死。该文对Wnt/β-catenin信号对细胞凋亡和坏死的调控研究进展进行综述。     

RNA干扰c-maf基因表达对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨RNA干扰c-maf基因表达对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制。方法:将人骨髓瘤细胞株NCI-H929分为正常对照组、转染si RNA Control的阴性对照组和转染si RNA c-maf基因的沉默组,转染48 h后,提取细胞中的蛋白,Western blot检测各组细胞中c-maf的蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved caspase3及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin和Cyclin D1蛋白表达。结果:阴性对照组c-maf的蛋白表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05),沉默组c-maf的蛋白表达显著低于正常对照组(P0.01),而阴性对照组c-maf的蛋白表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。与阴性对照组比较,沉默组的细胞凋亡率显著升高,Cleaved caspase3蛋白显著上调表达,β-catenin和Cyclin D1蛋白显著下调表达(P0.01)。结论:RNA干扰c-maf基因表达可诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

葡萄籽原花青素对人骨肉瘤143B细胞的作用及机制研究

该文研究葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins,GSP)对人骨肉瘤143B细胞增殖、凋亡的影响及其机制。用不同剂量GSP处理骨肉瘤143B细胞,结晶紫染色和集落形成试验分别用于检测细胞增殖和集落形成能力的变化;流式细胞术检测细胞周期与凋亡,Western blot法检测周期和凋亡相关蛋白;RT-PCR和Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达的变化;采用腺病毒Adβ-catenin感染以过表达β-catenin,探讨GSP抑制143B细胞增殖的作用是否与Wnt/β-catenin信号通路相关。结果显示,GSP在20~60μg/m L剂量范围内呈剂量和时间依赖性抑制143B细胞增殖活力和降低细胞克隆形成能力;GSP引起G0/G1周期阻滞和周期相关蛋白cyclin D1下调,还使细胞凋亡率明显增高,并伴有活化的凋亡相关蛋白cleaved PARP(poly ADP-ribose polymerase)和cleaved caspase-8的水平增高;GSP降低143B细胞中β-catenin m RNA水平及核内与总β-catenin蛋白质水平,抑制GSK3β磷酸化并上调GSK3β蛋白质水平;过表达β-catenin可部分减弱GSP对该细胞增殖活性的抑制作用。结果表明,GSP抑制骨肉瘤143B细胞的增殖和促进其凋亡,其机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的抑制。     

VD通过VDR下调β-catenin磷酸化水平抑制胃癌细胞增殖

为探讨维生素D(vitamin D, VD)及维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)对胃癌细胞增殖的作用及分子机制,该研究首先通过免疫荧光实验观察胃癌细胞SGC-7901和MKN-45中VDR的表达水平,进一步利用shRNA干扰慢病毒转染两种胃癌细胞,嘌呤霉素筛选建立shVDR稳定株,应用CCK8及细胞集落形成实验,流式细胞学实验, Western blot实验检测VD/VDR在两种胃癌细胞恶性表型增殖及细胞周期中的作用;最后再次应用Western blot实验检测VD/VDR对胃癌细胞中β-catenin磷酸化表达水平的影响。结果表明两种胃癌细胞均表达VDR;在配体骨化三醇(1α,25(OH)_2D_3)存在的情况下,胃癌细胞的增殖和集落形成受到明显抑制,同时抑制β-catenin的磷酸化水平,但对细胞周期分布及细胞周期蛋白Cyclin D1无明显作用。下调VDR的表达水平后, VD对β-catenin磷酸化表达水平无明显影响。证实VDR通过下调β-catenin的磷酸化水平,发挥抑制胃癌细胞增殖的作用。     

人巨细胞病毒感染通过Wnt/β-catenin通路抑制滋养细胞的增殖及侵袭

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)感染能够影响胎盘绒毛外滋养细胞的增殖、侵袭,进而参与病理妊娠的发生,但具体的机制尚未阐明.在真皮成纤维细胞中的研究表明,HCMV能够抑制Wnt/β-catenin通路.因此,为了观察HCMV感染通过Wnt/β-catenin通路抑制滋养细胞增殖及侵袭的作用,本研究培养了人绒毛外滋养细胞株HTR8/SVneo.研究分为对照组、HCMV组、HCMV+LiCl组细胞.对照组细胞用培养液处理,HCMV组细胞用含有3个感染复数(Multiplicity of infection,MOI)HCMV的培养液处理,HCMV+LiCl组细胞用含有3MOI HCMV及50mmol/L Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl的培养液处理.48小时后,采用MTS法检测细胞增殖,采用Transwell检测细胞侵袭,采用western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)、β-连环蛋白(β-catenin)和磷酸型糖原合酶激酶-3β(p-GSK-3β)的表达量.结果显示,与对照组细胞相比,HCMV组细胞的O.D490水平、侵袭数目及cyyclinD1、MMP2、MMP9、β-catenin、p-GSK-3β的表达量均降低(P＜0.05);与HCMV组细胞比较,HCMV+LiCl组细胞的O.D490水平、侵袭数目及cyclinD1、MMP2、MMP9、β-catenin、p-GSK-3β的表达量均增加(P＜0.05).以上结果表明,HCMV感染抑制人绒毛外滋养细胞的增殖和侵袭,且该作用与抑制Wnt/β-catenin通路有关.本研究阐明了HCMV感染通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而抑制滋养细胞增殖及侵袭的分子机制,为最终阐明HCMV先天感染的致病机理积累了有价值的研究资料.     

当归多糖延缓5-氟尿嘧啶所致人骨髓基质细胞衰老

探讨5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cell,h BMSC)的损伤作用机制;当归多糖(angelica sinensis polysaccharides,ASP)对5-氟尿嘧啶损伤h BMSC的保护作用。采用CCK-8法测定人骨髓基质细胞株HS-5对不同浓度5-FU(0μg/mL,12.5μg/mL,25μg/mL,50μg/mL和100μg/mL)的敏感性。流式细胞术分析细胞周期;β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞;DCFH-DA荧光染色流式检测胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;酶学法检测谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量;流式细胞术分析γH2AX表达水平;ELISA检测8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHd G)的含量;5-FU 12.5~100μg/mL抑制HS-5增殖,抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性。5-FU组较与对照组相比细胞周期发生G1期阻滞,β-半乳糖苷酶染色阳性率升高;胞内ROS含量显著升高;细胞抗氧化能力降低;γH2AX和8-OHd G表达水平增高。ASP治疗组较5-FU组细胞相比细胞周期阻滞减少;衰老细胞比率降低;胞内ROS含量显著降低;细胞抗氧化能力升高;DNA损伤指标表达水平降低。5-FU可通过增强氧化应激诱发DNA损伤致骨髓基质细胞衰老;ASP对骨髓基质细胞损伤有保护作用,其机制可能与ASP降低损伤后骨髓基质细胞氧化应激减轻DNA损伤从而延缓骨髓基质细胞衰老有关。     

FBXO31基因对宫颈癌细胞增殖的影响

为了探讨FBXO31在宫颈癌中的表达情况及其对宫颈癌细胞增殖的影响及其可能机制,本研究采用实时定量PCR法检测FBXO31在宫颈癌组织中的表达水平;MTT法检测Hela细胞增殖能力;流式细胞术检测Hela细胞周期分布;Western blotting检测Hela细胞FBXO31、β-catenin、CyclinD1和c-Myc蛋白的表达水平。研究结果表明,FBXO31在宫颈癌组织中表达明显下调(p0.05)。FBXO31过表达能够明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖能力。与空载质粒组比较,过表达FBXO31组的G1期细胞数显著增加,S期细胞数明显降低(p0.05)。本研究还发现FBXO31过表达能明显下调β-catenin蛋白、cyclin D1和c-Myc蛋白水平(p0.05)。本研究结论表明,FBXO31基因在宫颈癌中低表达;过表达FBXO31基因可通过抑制Wnt/β-catenin通路从而抑制宫颈癌细胞增殖。     

HepaCAM通过Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞T24的增殖

该研究探讨了肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,Hepa CAM)对膀胱癌细胞T24增殖的影响及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。T24细胞做空白处理、空载腺病毒(Ad-GFP)处理和Hepa CAM过表达腺病毒(Ad-GFP-Hepa CAM)处理,CCK-8法检测Hepa CAM对细胞增殖的影响,q RT-PCR和Western blot法检测Hepa CAM对β-catenin、c-Myc和cyclin D1的m RNA和蛋白表达水平的影响。采用Wnt/β-catenin信号通路激活剂Li Cl处理T24细胞,MTT法检测细胞增殖能力,Western blot检测GSK3β(try216)磷酸化水平及β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白水平,克隆形成试验检测细胞的克隆形成能力。结果显示,过表达Hepa CAM后,能够抑制T24细胞的生长,下调β-catenin、c-Myc及cyclin D1的m RNA和蛋白的表达水平。5,10,20μmol/L的Li Cl作用细胞2 h后,均可促进T24细胞的增殖。10μmol/L的Li Cl作用2 h后能够降低GSK3β的磷酸化水平,促进Wnt信号通路的活化。10μmol/L的Li Cl与Ad-GFP-Hepa CAM联合处理细胞后,能够逆转Hepa CAM对β-catenin、c-Myc及cyclin D1蛋白水平和细胞增殖的抑制作用。该研究表明,Hepa CAM可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞T24的增殖。     

lncRNA CCAT2调控SIRT1蛋白表达激活Wnt/β-catenin通路影响非小细胞肺癌细胞增殖和转移

该文旨在分析长链非编码RNA(lncRNA) CCAT2通过调控SIRT1蛋白的表达激活Wnt/β-catenin信号通路进而影响非小细胞肺癌细胞增殖和转移的机制。采用qRT-PCR检测肺癌组织及肺癌细胞株中lncRNA CCAT2的表达。利用卡方检验分析lncRNA CCAT2表达与肺癌患者临床病理特征的关系。CCK-8实验、划痕实验及Transwell实验观察敲低lncRNA CCAT2表达对肺癌细胞增殖、迁移及浸润能力的影响。Western blot检测敲低lncRNA CCAT2表达对H1975细胞株中SIRT1蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响;以及敲低或过表达SIRT1对Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响。利用RNA免疫共沉淀(RIP)及RNA pull-down实验验证lncRNA CCAT2与SIRT1之间的相互作用。该研究得出,癌组织及肺癌细胞株中lncRNA CCAT2表达显著较高(P0.05),敲低lncRNA CCAT2表达能够抑制H1975细胞的增殖、迁移及浸润。敲低lncRNA CCAT2表达后,H1975细胞株中SIRT1、β-catenin、Cyclin D1、myc蛋白的表达降低;敲低SIRT1后,细胞核β-catenin蛋白、Cyclin D1、myc蛋白的表达均降低。与非特异性抗体比较,SIRT1抗体呈明显的lncRNA CCAT2富集;lncRNA CCAT2的截短突变组细胞中SIRT1相对表达量明显低于lncRNA CCAT2组。lncRNA CCAT2通过调控SIRT1蛋白表达激活Wnt/β-catenin信号通路进而促进肺癌细胞增殖、迁移及浸润,有望成为新的肿瘤标志物。     

下调TRPC5的表达对卵巢癌细胞耐药性影响的研究

为探究瞬时受体通道5(transient receptor potential canonical 5, TRPC5)是否参与影响卵巢癌细胞对紫杉醇(paclitaxel, PTX)的耐药性,转染TPRC5-siRNA至A2780/PTX细胞。MTT检测A2780/WT、A2780/PTX和A2780/PTX细胞+siTRPC5对紫杉醇的敏感性; RT-PCR和Western blot检测TRPC5、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的mRNA和蛋白表达水平;细胞免疫荧光检测β-catenin、c-myc和Cyclin D1蛋白的表达水平。MTT、RT-PCR和Western blot结果显示, A2780/PTX细胞对PTX的敏感性(IC50=84.4μmol/L)低于A2780/WT细胞(IC50=1.98μmol/L), A2780/PTX细胞的TRPC5和P-gp的mRNA和蛋白表达水平显著高于A2780/WT细胞;用siTRPC5敲低A2780/PTX细胞TRPC5的表达水平,可显著减少其P-gp的表达量,降低A2780/PTX细胞对PTX的敏感性。细胞免疫荧光实验结果显示,降低A2780/PTX细胞TRPC5的表达水平,细胞核中β-catenin的表达量减少,且Cyclin D1和c-myc的表达量也明显降低。TRPC5参与影响卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药性,并且通过Wnt/β-catenin信号通路影响耐药蛋白P-gp的表达进而影响其耐药性。     

盐霉素抑制急性早幼粒细胞白血病细胞增殖并诱导分化

该文旨在探讨盐霉素(salinomycin,SAL)对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞增殖和分化的影响及其可能的机制。采用CCK-8(cell counting kit-8)实验检测细胞增殖,瑞氏染色观察细胞形态学变化,流式细胞术检测粒细胞分化标志物CD11b的表达,Western blot检测相关蛋白质水平变化。结果显示,SAL抑制了细胞增殖;SAL作用72 h后,细胞呈现典型分化形态学改变。随着SAL的浓度升高,CD11b阳性的细胞比例以及CD11b、C/EBPβ蛋白质水平逐渐增加。此外,SAL降低了β-catenin以及下游分子C-myc、Cyclin D1的蛋白质水平。该研究还探讨了联合使用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂IWR-1与SAL对细胞分化的影响。结果显示,与单独使用SAL相比,联合使用SAL和IWR-1促进了SAL诱导的NB4细胞分化。该研究结果提示,SAL可抑制NB4细胞的增殖,并可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路诱导细胞分化。     

地龙蛋白对人增生性瘢痕细胞增殖抑制作用机制研究

目的:研究地龙蛋白对人增生性瘢痕细胞增殖抑制作用机制。方法:培养人增生性瘢痕成纤维细胞(HSF),将传代好的HSF细胞分为四组,分别加入地龙样品浓度为0 mg/m L(对照组)、0.3125 mg/m L(低剂量组)、0.625 mg/m L(中剂量组)、1.25 mg/m L(高剂量组)。应用MTS法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR法和Western-blot法测定Cyclin D1、Caspase-3、TGF-β1的表达,Western-blot法测定Bcl-2、Mcl-2的表达。结果:地龙蛋白对HSF细胞的增殖活力有抑制作用。浓度0.625mg/m L、1.25 mg/m L样品组作用细胞48 h后凋亡率为分别为31.5%和69.2%,(P0.01);RT-PCR显示,浓度0.625 mg/m L、1.25mg/m L样品组能够增加Caspase-3的基因表达,降低Cyclin D1的基因表达,降低TGF-β1的基因表达,(P0.01);浓度0.3125mg/m L样品组与空白对照组比较有显著性差异(P0.05)。W-B方法显示,各样品组能够增加Caspase-3的蛋白表达量,降低Cyclin D 1的蛋白表达量,降低TGF-β1的蛋白表达量,(P0.01);浓度0.625 mg/m L、1.25 mg/m L样品组能够降低Bcl-2蛋白表达量,(P0.01);浓度0.3125 mg/m L样品组Bcl-2的蛋白表达量与空白对照组比较有显著性差异(P0.05)。结论:地龙蛋白诱导细胞死亡,作用机制与下调Cyclin D1的基因和蛋白表达,上调Caspase-3的基因和蛋白表达,下调TGF-β1的基因和蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达量有关。     

TGF-β信号通路抑制剂LY364947对急性髓系白血病细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

该文旨在探讨抑制TGF-β信号通路对人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞体外增殖、凋亡和侵袭能力的影响。使用不同浓度TGF-β信号通路抑制剂LY364947处理AML细胞系(KG1a、OCI-AML3)后,采用CCK-8实验检测细胞体外增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡情况; Western blot检测细胞周期调控因子Cyclin D1/p21、凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax以及上皮细胞间质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表达; Transwell实验测定AML细胞迁移及侵袭能力的变化。结果显示:LY364947作用后,白血病细胞生长明显受抑制;细胞周期阻滞在G1期,伴有Cyclin D1表达下调和p21表达上调;细胞凋亡率增加,同时细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下降,促凋亡蛋白Bax表达增高;细胞体外迁移和侵袭能力减弱。此外, E-cadherin表达增高, N-cadherin和vimentin表达下降。该研究结果提示,抑制TGF-β信号通路能够抑制白血病细胞的体外增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞迁移及侵袭能力。     

羽扇豆醇通过抑制RhoA-ROCK1信号通路抑制结肠癌细胞增殖

该文探讨了羽扇豆醇(Lupeol)对人结肠癌HCT116和SW620细胞增殖的影响及相关作用机制。使用不同浓度的Lupeol处理HCT116和SW620细胞后,用MTT法检测细胞活性,CCK8法检测细胞增殖能力,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blot检测相应mRNA和蛋白表达水平,免疫荧光检测β-Catenin蛋白细胞内分布情况。通过构建shRNA敲低两种结肠癌细胞中RhoA,进一步研究Lupeol影响细胞增殖的分子机制。结果显示,Lupeol处理后,HCT116和SW620细胞增殖能力明显下降,克隆形成能力受到抑制,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞内RhoA、ROCK1、β-Catenin、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平均显著下降,β-Catenin蛋白胞质和胞膜上分布减少。敲低RhoA后抑制了细胞增殖,同时使得RhoA-ROCK1-β-Catenin信号通路蛋白受到抑制,β-Catenin蛋白胞质和胞膜上分布减少。综上所述,Lupeol可通过抑制RhoA-ROCK1信号通路,抑制β-Catenin蛋白表达,进而抑制HCT116和SW620细胞增殖,Lupeol有望成为临床结肠癌治疗的新药物。     

全反式维甲酸诱导胃腺癌细胞周期阻滞的作用机制

目的:研究全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)对人胃腺癌细胞(SGC-7901)细胞周期阻滞的诱导作用并探讨其机制.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测ATRA对SGC-7901增殖的抑制;流式细胞术检测细胞周期,Western blot方法检测不同浓度ATRA处理后的SGC-7901细胞中Akt、P-Akt(Ser473)、P-Akt(Thr308)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1的表达情况.结果:10.9～10.5mol/L的ATRA作用SGC-7901细胞48 h,能显著抑制细胞增殖,其抑制率分别为10.2%±0.5%、15.3%±0.5%、17.0%±0.7%、28.4%±1.0%和36.9%±0.7%;G1期细胞比率随着ATRA浓度的增加而增加,呈明显的G1期阻滞;Western blot检测显示ATRA对细胞中Akt蛋白的表达没有明显影响,两种p-Akt蛋白的表达显著下调,ATRA显著降低细胞中cyclin D1和p-GSK-3β的表达.结论:ATRA可能通过抑制磷酸化Akt蛋白表达而减少p-GSK-3β的表达,从而减少cyclin D1的表达量,进而诱导SGC-7901细胞发生G1期阻滞.     

LncRNA MEG3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)人母系表达基因(Maternally expressed gene 3,MEG3)对骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:选取我院住院的OA患者和半月板损伤患者各40例,采用RT-PCR检测两组患者软骨组织和细胞中MEG3的表达。在OA软骨细胞中,转染si RNA-MEG3(si-MEG3)或过表达MEG3的慢病毒载体(LV-MEG3),采用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,RT-PCR和western blot检测PCNA、Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达。结果:OA患者膝关节软骨组织中MEG3的表达水平明显低于半月板损伤患者软骨组织(P0.05),同时OA软骨细胞中MEG3的表达水平明显低于正常软骨细胞(P0.05)。OA软骨细胞转染siMEG3后,细胞增殖能力和PCNA表达明显下降(P均0.05),G0/G1期细胞比例明显升高(P0.05),S期细胞比例明显下降(P0.05),细胞凋亡率明显增加(P均0.05)。低表达MEG3能够显著降低Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达水平(P均0.05),增加GSK-3βm RNA和蛋白表达水平(P均0.05)。在OA软骨细胞转染LV-MEG3后,细胞增殖能力和PCNA表达明显升高(P均0.05),G0/G1期细胞比例明显下降(P0.05),S期细胞比例明显增加(P0.05),细胞凋亡率明显减少(P均0.05)。高表达MEG3能够显著增加OA软骨细胞中Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达水平(P均0.05),降低GSK-3βm RNA和蛋白表达(P均0.05)。同时,采用XAV939阻滞Wnt/β-catenin信号通路能够显著逆转过表达MEG3对OA软骨细胞增殖和凋亡的影响。结论:MEG3在OA患者和软骨细胞中均显著低表达,并能够通过阻滞Wnt/β-catenin信号通路激活影响OA软骨细胞增殖和凋亡。MEG3可能成为OA治疗的重要靶分子。     

红景天苷通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化

目的:以小鼠骨髓间充质干细胞系D1细胞为研究对象,探讨Wnt/β-catenin信号通路介导的红景天苷诱导D1细胞向神经细胞的定向分化。方法:实验分为对照组(D/F12完全培养基)和红景天苷诱导组(100μg/mL+D/F12完全培养基).将细胞分别诱导12、24、48和72 h后,采用细胞免疫荧光化学染色方法检测β-catenin和Gsk-3β的阳性细胞率。利用红景天苷分别诱导MSCs 1,2,8,12,24,48和72 h后,利用实时PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达;采用Westernblot方法分析D1细胞诱导12、24、48和72 h后,β-catenin和Gsk-3β蛋白的表达;运用Wnt/β-catenin信号通路特异性阻断剂DKK1阻断Wnt/β-catenin信号通路,Western blot方法分析红景天苷对β-catenin和NSE蛋白表达的影响。结果:红景天苷诱导24 h时β-catenin的阳性率可达55.76%,与其他组和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),诱导24 h后Gsk-3β的阳性率与其他时间和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。实时PCR检测结果显示,红景天苷诱导MSCs不同时间能促进Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子Wnt3a、Ax-in2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达,诱导不同时间Wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达不尽相同。Westernblot结果表明,红景天苷诱导D1细胞12 h和24 h时β-catenin蛋白的表达明显上调,且与其他组比较差异具有统计学意义(P<0.05);随着作用时间的延长,Gsk-3β蛋白的表达增加且差异具有统计学意义(P<0.05),阻断Wnt/β-catenin信号通路后,β-catenin和NSE蛋白的表达水平明显下调。结论:红景天苷能诱导D1细胞定向分化为神经元样细胞,红景天苷通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现其诱导MSCs向神经细胞定向分化。     

MITF在葡萄膜黑色素瘤细胞中的功能研究

该研究首先通过qRT-PCR和Western blot发现,MITF在人葡萄膜黑色素瘤细胞中的RNA水平及蛋白水平都显著高于葡萄膜黑色素细胞中的水平。通过RNA干扰技术下调葡萄膜黑色素瘤细胞中的MITF的表达,采用MTS实验、细胞平板克隆实验发现,MITF下调后葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖能力被显著抑制。利用流式细胞术及Hoechst染色、Caspase 3/7活性检测发现其细胞周期受到阻滞,且凋亡水平增加。通过RTCA xCELLigence DP检测系统定量检测发现,si-MITF能抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的迁移及侵袭能力。Western blot检测发现,MITF下调后葡萄膜黑色素瘤细胞中细胞周期相关蛋白p-Rb(retinoblastoma)、CDK2(cyclin-dependent kinase 2)、CDK6、细胞周期蛋白D2(Cyclin D2)以及CyclinE2的表达水平下调,与增殖及迁移侵袭密切相关的FAK(focal adhesion kinase)及ERK(extracellular signal-regulated protein kinases)蛋白的磷酸化水平降低。该研究表明,在葡萄膜黑色素瘤细胞中下调MITF的表达后,细胞内部分周期相关蛋白、细胞增殖及迁移侵袭相关蛋白的表达均有下调,导致细胞发生G_1期阻滞,使细胞的增殖、迁移及侵袭能力受到抑制,同时也促使细胞发生凋亡。