‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析

4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶（CMK）是萜类花香合成甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径的关键酶,为揭示其对百合花香的调控作用,从‘西伯利亚’百合（Lilium ‘Siberia’）中克隆LiCMK基因,进行生物信息学分析,利用亚细胞定位确定蛋白位置,采用荧光定量PCR技术检测基因时空表达模式,并运用病毒诱导基因沉默（VIGS）方法瞬时沉默LiCMK,验证其功能。结果显示,LiCMK全长1 200 bp,编码399个氨基酸,属于IspE家族,与油棕（Elaeis guineensis）中的CMK相似度最高。LiCMK的表达随花期呈现先上升后降低的规律,在盛花期的表达量达到峰值,在花器官中的表达量明显高于茎、叶中的表达量。LiCMK蛋白定位于叶绿体中。LiCMK在百合中瞬时沉默后,LiCMK表达水平下降了约84%,主要的单萜合成基因表达量明显下降,月桂烯合酶基因（MYS）、罗勒烯合酶基因（OCS）和芳樟醇合酶基因（LIS）分别降低了57%、59%和63%,主要的单萜类化合物月桂烯、罗勒烯和芳樟醇释放量显著下降。结果表明,LiCMK基因对‘西伯利亚’百合单萜化合物的合成与花香释放有重要...     

淡色库蚊ATP合酶B亚基基因克隆和序列分析及其与溴氰菊酯抗性的关系

【目的】克隆淡色库蚊Culex pipiens pallens ATP合酶B亚基基因编码区序列,并进行生物信息学分析,研究其与溴氰菊酯抗性关系。【方法】通过PCR方法扩增ATP合酶B亚基基因编码区序列;利用生物信息学网站在线分析工具,预测ATP合酶B亚基基因编码蛋白的理化性质和功能特征;通过实时定量PCR方法比较ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊溴氰菊酯敏感品系和抗性品系中的表达,并在现场种群溴氰菊酯敏感和抗性个体中做进一步验证。【结果】成功克隆淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列(Gen Bank登录号:KY783434),长717 bp,编码238个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白理论相对分子量为26.96 k D,等电点为8.97,在第70-231位氨基酸具有ATP合酶B亚基结构域,未发现信号肽和跨膜区。实时定量PCR结果显示,ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊抗溴氰菊酯品系和现场种群溴氰菊酯抗性个体中表达量均上调。【结论】本研究获得了淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列,进行了生物信息学分析,并证实其在溴氰菊酯抗性个体中高表达,为进一步研究该基因在蚊抗药性中的作用奠定了基础。     

北美鹅掌楸LtuFPPS1基因克隆与组织表达分析

法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS)是植物萜类物质合成前体法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)的关键合成酶。为探究北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)萜类合成途径的分子机制,该文利用北美鹅掌楸转录组数据,通过设计特异性引物,采用RACE技术克隆得到LtuFPPS1基因的全长序列并进行生物信息学分析。结果表明:(1) LtuFPPS1基因全长1 460 bp,开放阅读框(ORF)长1 056 bp,编码351个氨基酸,蛋白质分子量为40 589.45 D,等电点为5.19,不稳定系数为43.50,归类为不稳定蛋白; LtuFPPS1基因所编码的蛋白不含信号肽,定位于线粒体,是一种不稳定亲水性蛋白,具有类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域,α-螺旋为其氨基酸序列的主要二级结构。(2)进化树和同源序列分析表明,北美鹅掌楸LtuFPPS1蛋白与乐昌含笑(Michelia chapensis)的FPPS蛋白的亲缘关系更近。(3)组织表达分析结果发现,LtuFPPS1基因在北美鹅掌楸雌蕊中的表达量最高,其高低顺序为雌蕊花芽茎雄蕊萼片叶片花瓣根,据此推测萜类代谢物在花器官中的合成相对较多。综上所述,LtuFPPS1基因为萜类合成酶基因,可为从分子生物学层面探究北美鹅掌楸萜类物质的合成提供一定的理论帮助。     

马铃薯萜类合酶基因StHcS的功能鉴定

为了研究马铃薯萜类代谢物的生物合成机制,从马铃薯基因组数据中筛选到一个萜类合酶基因。通过RT-PCR方法,从致病疫霉侵染后的马铃薯品种‘费乌瑞它’中成功克隆到该基因,命名为StHcS,并对其进行生物信息学分析、生化功能鉴定及表达模式分析。结果表明:(1)序列分析显示StHcS编码区序列长1 497 bp,编码498个氨基酸,分子质量为74.78 kD。(2)StHcS基因编码的蛋白序列含有DDXXD催化功能域,与短柱茶(Camellia maliflora)中的四甲基环癸二烯甲醇合酶相似度最高。(3)蛋白体外催化实验和大肠杆菌代谢工程分析表明,StHcS可以催化生成倍半萜化合物四甲基环癸二烯甲醇(hedycaryol)。(4)基因表达分析显示,StHcS可以被致病疫霉侵染诱导表达反式法尼烯焦磷酸(FPP),且在侵染后72 h表达最高;GC-MS分析显示,在受侵染的马铃薯块茎中检测到四甲基环癸二烯甲醇。StHcS生化功能的鉴定为倍半萜合酶的研究提供了多样性,也是首次在马铃薯中发现的四甲基环癸二烯甲醇合酶,为马铃薯萜类代谢途径解析提供了参考。     

夏枯草PvGGPPS基因的克隆和诱导表达分析

为探究夏枯草中GGPPS基因的生物学特性及功能,该文在夏枯草转录组测序的基础上设计特异性引物,采用逆转录PCR技术获得夏枯草中GGPPS基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析;采用qPCR法分析PvGGPPS基因在不同外源性物质诱导下在夏枯草果穗中的表达量以及该基因在夏枯草不同组织中的表达量。结果表明:PvGGPPS基因开放阅读框1 092 bp,编码363个氨基酸,理论分子量为38 815.68 D,等电点为5.69。PvGGPPS蛋白具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域。系统进化树表明PvGGPPS蛋白与丹参、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有较高的亲缘关系。qPCR分析表明,PvGGPPS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA3处理组该基因表达量升高。PvGGPPS基因在夏枯草不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。该研究结果为进一步研究PvGGPPS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

油橄榄HMGR基因家族的克隆表达及功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)生成甲羟戊酸(MVA),是MVA途径中第一个关键酶。油橄榄是一种重要的经济油料作物,其含有的萜类物质具有重要营养价值,但关于调控萜类物质代谢途径的关键基因研究较少。为研究萜类合成途径关键酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄榄HMGR基因,进行生物信息学分析及构建原核表达载体,对表达蛋白生物活性进行功能验证,并采用荧光定量PCR分析HMGR在油橄榄不同生长阶段的表达量。结果表明:克隆出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的长度分别为1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,编码570、590、578个氨基酸;基因编码蛋白均有2个跨膜区及HMGR催化活性的结构域,不含信号肽;构建了原核表达载体p ET30b(+)-Oe HMGR,转入到大肠杆菌BL21中成功表达,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.2~68.0 k D之间,分离纯化重组蛋白进行功能验证,GC-MS检测表明该蛋白具有HMGR催化活性功能;荧光定量PCR分析表明该家族基因在果实和叶片中表达量较高,而在根、茎、花中表达量较低,在开花后45 d、90 d、120 d表达量较低,但在花后165 d表达量上升至较高水平。该研究为进一步鉴定Oe HMGR的功能及油橄榄萜类物质的合成生物学研究奠定基础。     

细辛苯丙素类化合物生物合成相关酶基因的挖掘及其表达分析

为了探明细辛苯丙素类化合物生物合成相关酶基因的表达水平,本研究基于实验室已构建好的细辛转录组数据库,根据基因功能注释筛选出与苯丙素类化合物生物合成相关酶基因,并推导其蛋白序列,进行生物信息学分析,同时对相关酶基因进行基因的表达分析。本文从细辛转录组数据库中筛选出了6个酶基因,分别为pal、c4h、comt、4cl、ccr、cad。基因编码蛋白特性分析结果表明:6个酶基因所编码的蛋白属于不同的超家族。基因表达分析结果表明:6个酶基因表达量呈现相同的变化规律。对于叶、叶柄、根、根茎,6个酶基因在花期的表达量较花前期的高;同时,6个酶基因在地下部分的表达量比地上部分的高。以上结果显示6个酶基因在细辛叶、叶柄、根、根茎的表达量差异明显,但具有一定的规律性。研究的成功开展为我们进一步了解苯丙素类化合物生物合成相关酶的功能和特性打下了基础,为今后细辛活性成分的生物合成及代谢调控提供理论依据。     

维药新塔花(Ziziphora bungena)zbHDS基因克隆及组织表达分析

对维药新塔花(Ziziphora bungena)萜类化合物生物合成途径中,关键酶1-羟基-2甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶HDS基因克隆,进行组织表达特异性分析,为研究新塔花萜类化合物生物合成途径与基因调控提供基础。结合新塔花转录组数据库,根据编码区序列设计引物,通过RT-PCR方法对Z. bungena基因HDS (zbHDS)的编码区cDNA进行克隆,对其进行相关生物信息学分析,通过Real-Time进一步分析其组织表达特异性。RT-PCR扩增了一个长2 465 bp的zbHDS (登录号:MG065856)基因片段,含一个2 229 bp的开放阅读框,编码742个氨基酸。进化树分析结果显示,与丹参(Salvia miltiorrhiza)具有较近的亲缘关系。Real-Time PCR结果显示zbHDS基因在各器官中均有表达,在茎和叶中表达量较高,根和花中表达量相对较低。本研究首次从新塔花中克隆HDS基因并获得其编码区序列,zbHDS基因具有组织表达特异性,为进一步研究新塔花中萜类化合物生物合成途径提供数据支持。     

广藿香FPPS基因原核表达及茉莉酸甲酯对FPPS表达量的影响

法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS)是广藿香甲羟戊酸途径中萜类物质生物合成的关键酶,其催化异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)合成萜类物质前体法尼基焦磷酸。为了进一步研究广藿香萜类合成途径的分子机制,该文通过逆转录聚合酶链式反应获得FPPS基因的cDNA序列,利用生物信息学软件预测FPPS编码蛋白的理化性质、结构和功能。结果表明:(1)该序列的开放阅读框全长1 050 bp,编码349个氨基酸,预测分子量为40 KD,等电点为5.43,存在一个结构域,参与异戊二烯化合物的合成,不存在信号肽,亚细胞定位于细胞质;系统发育分析结果显示,广藿香FPPS氨基酸序列和丹参(Salvia miltiorrhiza)、撒尔维亚(S. officinalis)的氨基酸序列亲缘关系最近。(2)使用无缝克隆技术构建pET-32b-FPPS原核表达载体,并导入菌株BL21(DE3)中,考察不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对诱导融合蛋白的表达量的影响。结果发现融合表达蛋白以包涵体形式存在沉淀中,4个浓度的IPTG诱导蛋白表达效果差异不明显。(3)采用荧光定量技术分析0.10、0.25 mmol·L-1MeJA对FPPS基因表达水平的影响,发现0.10 mmol·L~(-1)MeJA诱导后FPPS基因的表达量趋势是先升高后降低再升高再降低; 0.25 mmol·L~(-1)MeJA诱导后FPPS基因的表达量趋势是先降低后升高再降低。因此,推测植物体内MeJA浓度的变化能影响FPPS基因的表达,高浓度具抑制作用,低浓度具促进作用。本研究为广藿香萜类合成途径的研究奠定基础,以及为后续基因功能验证提供理论参考。     

冬凌草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆与表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)是植物萜类代谢通路中2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成中发挥重要的作用.为了研究该基因在冬凌草二萜类成分合成中的作用,该研究在冬凌草转录组测序结果的基础上设计一对特异性引物,采用RT-PCR方法得到冬凌草IrDXS基因cDNA全长序列,并对其蛋白进行理化性质分析、信号肽预测、亚细胞定位预测、蛋白质二级结构、三级结构预测分析及跨膜域分析等生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR的方法检测IrDXS基因在冬凌草不同部位中的表达情况.结果表明:从冬凌草叶片中分离得到了一条编码DXS的全长基因,通过生物信息学软件分析发现,该基因编码全长2169 bp,编码722个氨基酸,分子量为77.7 kD.多序列比对发现该基因编码的蛋白和其他植物中已知的DXS蛋白序列具有较高的同源性,N端均包含了一段质体转运肽序列,并均具有一个保守的焦磷酸硫胺素结构域和与吡啶结合相关的DRAG结构域.序列进化树分析显示,IrDXS基因属于植物DXS2家族.DXS基因在冬凌草根中表达量最高、愈伤组织中最低.该研究首次获得了IrDXS基因的全长cDNA序列,并揭示了其在不同组织中的表达差异,为后续的深入研究IrDXS基因在冬凌草二萜类成分合成途径中的功能奠定了基础.